丁基苯酞对脑缺血模型谷氨酸兴奋性毒性作用的调控机制

赵慧颖，黄昕艳，李 航，闵 程，郑勇骐，闫 畅，郭 淼，戚询中,朱晓峰

(1.佳木斯大学；
2.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154000；
3.伊春市林业中心医院，黑龙江 伊春 153000；
4.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154000；
5.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑血管病是目前威胁人类健康的重大疾病之一，多发于中老年人群，且有年轻化趋势。目前针对此疾病的治疗手段较少，尤其对于无法进行超早期溶栓治疗的患者，现有治疗效果仍难以令人满意。丁基苯酞是我国具有知识产权的化学新药，具有多种药理作用；
既往报道指出，丁基苯酞能够减轻脑缺血后认知障碍[1]，减轻炎症[2]，具有多种脑保护作用[3]。于2002年，中国国家食品与药品监督管理局正式批准其在缺血性脑血管疾病中应用[4]，但目前其具体作用机制尚不明确。兴奋性氨基酸是中枢神经系统的兴奋性神经递质。脑缺血损伤的机制也涉及兴奋性氨基酸，包括谷氨酸的大量堆积即可导致细胞的调亡[5-7]。谷氨酸转运体在维持胞外谷氨酸含量上具有重要作用。有研究证实在体外神经元缺氧、复氧损伤模型中，谷氨酸对损伤神经元起保护作用。此外，大鼠脑皮质中EAAT2过表达，可显著减少脑缺血导致的谷氨酸外流、细胞凋亡并促进神经功能恢复[8]。而PI3K/AKT信号通路能够改善缺血再灌注后的血脑屏障功能，继而减轻血管源性脑水肿和恢复脑组织内环境稳定[9]。本课题拟观察丁基苯酞对MCAO大鼠模型的治疗作用及对谷氨酸兴奋性毒性作用的调节蛋白表达的影响，分析丁基苯酞在缺血性脑血管疾病的治疗作用机制，为期临床机制的阐述提供试验依据。

1.1 材料与试剂RT Master Mix(Takara RR036A)、Premix Ex TaqTMII(Takara RR420L)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天P0010S)、EAAT2(EAAT2) Antibody(博士德PB0293)、EAAT1(EAAT1) Antibody(博士德BA0892-2)、GAPDH Antibody(博士德A00227-1)、丁基苯酞(石药集团恩必普药业)等。

1.2 实验动物选用6～7周龄SD雄性大鼠，体重约为250～270 g，实验动物均购自佳木斯大学实验动物中心[合格证号：SYXK(黑)2021-018]，使用无菌木屑做垫料，环境温度保持在22～24 ℃，湿度保持45%～55%，使用每天12 h制的明/暗周期，并为其提供足够的食物和饮用水。动物适应性喂养3 d后开始实验，实验动物采取单笼喂养，自由进食。动物实验操作符合动物管理及保护规定，符合伦理学要求。

1.3 脑缺血模型建立、分组及评估采用随机数字表法将实验动物分为三组，每组实验动物15只：Sham组(假手术组：不行大脑中动脉阻塞操作)、MCAO组(采用Longa线栓法构建大脑中动脉阻塞模型[10])及NBP组[采用Longa线栓法构建大脑中动脉阻塞模型，造模完成后第二天给予丁基苯酞灌胃，溶剂为花生油(100 mg/kg，该浓度参照于一个NBP对局灶性脑缺血模型神经保护的研究中使用的浓度[11])，1次/d，持续7 d]；
Sham组及MCAO组同时给予等体积溶剂灌胃；
采用Zea Longa5等级评分法对Sham组、MCAO组、NBP组实验大鼠进行神经功能评分：评分包含0～4分，得分越高则表明神经功能缺损越严重。1～3分纳入实验，0及4分剔除。干预完成后断头取脑，取手术侧缺血区皮质，液氮保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR检测选用trizol法提取组织总RNA，应用逆转录试剂盒合成cDNA，选用SYBR Green I嵌合荧光法进行 Real Time PCR，计算2-△△CT值进行统计学分析。引物序列见(表1)。

表1 引物序列

1.5 Western blot检测选用含蛋白酶及磷酸酶的RIPA裂解液提取各组样本总蛋白，应用BCA法检测样本蛋白浓度，后经电泳、PVDF膜转膜、5%脱脂奶粉封闭，一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶1000)孵育2 h后显影发光，依据条带灰度值比值进行统计学分析。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0进行统计学处理，计量资料以“均数±标准差”表示，两组比较选用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05代表具有统计学差异。

2.1 神经功能评分Sham组大鼠无肢体障碍出现；
治疗前MCAO组与NBP组神经功能评分对比无差异；
经丁苯酞治疗后，NBP组较MCAO组功能评分明显降低(P<0.05)(表2)，具有统计学意义。

表2 神经功能评分

2.2 实时荧光定量PCR检测EAAT1、EAAT2结果经实时荧光定量PCR检测发现NBP组EAAT1、EAAT2 mRNA表达较MCAO组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 各组EAAT2、EAAT1 mRNA表达变化

2.3 Western blot检测EAAT1、EAAT2结果经实Western blot检测发现NBP组EAAT1、EAAT2蛋白水平较MCAO组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(见表4、图1)。

表4 各组EAAT2、EAAT1蛋白表达变化

图1 各组细胞EAAT1、EAAT2表达情况

2.4 实时荧光定量PCR检测AKT结果经实时荧光定量PCR检测发现MCAO组AKT mRNA表达为(1.041±0.306)，NBP组AKT mRNA表达明显升高，为(1.462±0.303)，与MCAO组比较结果具有统计学意义(P<0.05)。

谷氨酸是中枢神经系统兴奋性神经递质，广泛参与神经系统各项生理活动，并通过“谷氨酸-谷氨酰胺循环”，维持其在细胞内外的动态平衡。在缺血缺氧条件下，能量代谢严重异常，细胞去极化，谷氨酸转运体功能异常，致使谷氨酸在细胞外大量堆积，过量的谷氨酸会引起细胞内Ca2+升高进而过度激活N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)及AMPA受体(AMPAR)，引起谷氨酸兴奋性毒性作用，并导致细胞凋亡的产生。在调节细胞外谷氨酸浓度过程中，兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporter,EAATs)发挥主要作用[12]，其中EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)是最丰富的谷氨酸转运体[13]。有研究表明，在脑皮质缺血发生后，EAAT1和EAAT2的表达均有升高[14]，这是机体应对谷氨酸毒性作用的自调节机制。在临床治疗中，如果能够扩大这种调节作用，将会减少神经系统损伤，起到神经系统保护作用。

丁基苯酞化学名为3-丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮[3-butyl-1 (3H) -isobenzofuranone]，又称芹菜甲素，于芹菜叶和茎中提取，既往报道丁基苯酞在缺血性脑血管病、阿尔茨海默病及高血压治疗中均有重要作用：研究显示，丁基苯酞能够调节癫痫模型鼠的谷氨酸平衡，其机制与CP-AMPARs有关[15]；
但其在脑缺血模型中的干预机制尚不完全清楚，本课题经过实验观察，结果显示：丁基苯酞能够降低MCAO模型大鼠Zea Longa评分，这一结果与既往研究结果相同；
同时，本课题结果显示，经过丁基苯酞处理后，MCAO模型大鼠皮质EAAT1和EAAT2的mRNA水平进一步升高；
应用Western blot检测其蛋白水平，其升高趋势与mRNA表达相同，这一结果说明丁基苯酞能够参与并调节MCAO模型大鼠皮质谷氨酸循环过程，其机制与调节EAAT1和EAAT2表达有关。EAAT1和EAAT2是谷氨酸再摄取的重要转运体，丁基苯酞促进EAAT1和EAAT2的表达可以进一步促进细胞外谷氨酸的在摄取，降低谷氨酸-钙超载连锁反应，进而阻断钙超载凋亡过程，发挥神经保护作用。

既往报道显示，PI3K/AKT途径参与减轻谷氨酸诱导的神经毒性作用[16]，AKT是mTOR同路的正向调节蛋白，广泛参与多种生理过程。为了分析丁基苯酞调解EAAT1和EAAT2表达的机制，本课题进一步分析了丁基苯酞干预后MCAO模型大鼠皮质AKT mRNA表达水平。结果显示：与Sham组比较，丁基苯酞处理后，MCAO模型大鼠皮质AKT mRNA表达水平明显升高，这一结果说明丁基苯酞能够激活PI3K/AKT途径使AKT表达。而这一结果可能是EAAT1和EAAT2表达升高的调解机制。

综上所述，本课题研究发现丁基苯酞能够降低MCAO模型大鼠Zea Longa神经功能评分，促进模型大鼠皮质EAAT1和EAAT2的表达，同时活化PI3K/AKT途径，提高AKT mRNA水平。说明丁基苯酞可发挥神经保护作用，具有临床应用价值。