纳米酶传感器在分析检测领域的应用进展

＊杭永正 江兰 邹立娜 潘洪志 马宏坤* 荣胜忠

（1.牡丹江医学院公共卫生学院 黑龙江 157011 2.牡丹江医学院附属红旗医院 黑龙江 157011 3.上海健康医学院协同科研中心 上海 201318）

天然酶作为一种生物催化剂可以高效催化生物体内的多种化学反应，促进新陈代谢、营养和能量转换等过程。但是，多数天然酶为蛋白质，容易受到蛋白酶抑制剂的影响降低催化活性，同时对环境要求较高，需要在温和的作用条件下才能发挥高效的催化能力，在高温、低温、强酸、强碱等条件下催化活性显著降低甚至失活。纳米酶是一种通过化学方法合成的人工酶，既保留酶的催化活性，又克服了天然酶的缺陷，具有易合成、稳定性高、成本低、易存储等诸多优点[1]。自发现Fe3O4纳米粒子具有类过氧化物酶活性（POD）后[2]，纳米酶引起了学者的广泛关注，越来越多的纳米酶被合成或改进性能。酶传感器是将酶作为生物敏感元件，通过换能器将目标物与酶相互作用产生的信号转换为可测量的信号，实现多种物质的定量检测。纳米酶的优异性能突破了天然酶在组装传感器中的局限，形成的纳米酶传感器受到学者的广泛关注，已应用于生物医学、食品安全、环境监测等多个领域。为此，本文综述了纳米酶材料的种类，重点综述了纳米酶传感器在分析检测领域的应用进展。

(1)贵金属纳米酶

贵金属纳米酶在不同条件下可表现类POD、类氧化酶（OXD）、类过氧化氢酶（CAT）和类超氧化物歧化酶（SOD）等活性。Li等发现Au、Ag和Pt等金属具有类POD和类CAT活性，并通过实验详细报告了Au、Ag和Pt的类POD和类CAT活性的催化机制，Au、Ag和Pt表面均能够吸附H2O2，在酸性和中性条件下显示出类POD活性，而在碱性条件下，H2O2倾向于酸式分解，表现出类CAT活性。此外，Chen等发现金纳米粒子（AuNPs）可表现葡萄糖氧化酶活性催化葡萄糖，反应过程与天然葡萄糖氧化酶相似。

(2)金属氧化物纳米酶

金属氧化物价态的转换是实现类POD活性的关键。Wang等通过有类POD活性的Fe3O4磁性纳米颗粒（Fe3O4MNPs）去除有机污染物，研究了Fe3O4MNPs类酶活性的催化机理，发现Fe2+和Fe3+为反应活性位点，当H2O2分子吸附在Fe3O4MNPs表面时，Fe2+和Fe3+激活H2O2生成羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-）/氢氧自由基（HO2·），诱导罗丹明B的降解和矿化。Wang等提出了一种发挥类SOD活性的CeO2纳米粒子的催化循环机制，HO2·吸附在CeO2表面后生成O2和H2O2，H2O2通过自身氧化分解形成氧自由基将Ce4+还原为Ce3+。此外，多种金属氧化物均被证实具有类酶活性（如MnO2、V2O5、TiO2、NiO2等）。

(3)碳基材料纳米酶

碳基纳米材料包括石墨烯、碳量子点（GQDs）和碳纳米管等,具有稳定性高、易于修饰、生物相容性好等诸多优点，备受研究者关注。Zhao等探讨了碳基纳米材料催化活性的自由基机理，认为羧基（-COOH）是催化活性位点，碳基材料的-COOH被氧化为过氧羧基（-COOOH）并伴随H2O2分解，进而（-COOOH）均裂生成·OH催化氧化3,3’，5,5’-四甲基联苯胺（TMB）产生颜色变化。Sun等分别使GQDs衍生物上的羰基（C=O）、羟基（O=C-O）、-COOH失活来探究其作为类POD的催化活性位点，结果发现C=O失活后GQDs催化活性显著降低，而C-OH失活后GQDs有较高的催化活性，故认为C=O是催化活性位点，C-OH可以抑制催化反应。

纳米酶具有易合成、催化活性好、稳定性高、成本低、易存储等诸多优点，解决了天然酶组装传感器的缺陷。纳米酶传感器已广泛应用于肿瘤标志物、小分子物质、重金属离子、细菌和蛋白质等的分析检测。

(1)肿瘤标志物的检测

①纳米酶电化学传感器。癌胚抗原（CEA）是一种广谱肿瘤标志物，常作为肺癌、胰腺癌、乳腺癌等的常规检测指标。Wang等[3]制备了花状过渡金属衍生物MMoO4（M=Co,Ni）作为电极基底材料，可为锚定抗体提供大量结合位点，使用中空硅纳米粒子负载Cu2+和透明质酸（HA）固定二抗（HMSNs-Cu2+@HA-Ab2），CEA可与HMSNs-Cu2+@HA-Ab2特异性结合固定到电极表面。在酸性条件下HMSNs-Cu2+@HA-Ab2释放Cu2+激活底物材料的类POD活性，产生电化学信号，基于此构建了纳米酶电化学传感器检测CEA，线性范围为0.01pg/mL～40ng/mL，检出限为0.0035pg/mL。

②纳米酶比色传感器。卵巢癌是女性常见癌症，由于早期症状不明显导致其死亡率较高、预后较差。血清人附睾蛋白4（HE4）是卵巢癌的重要标志物，实现其灵敏、特异检测至关重要。Zhang等[4]制备了类POD活性的二硫化钼纳米片（MoS2NSs），可与单链DNA特异性结合。通过2,2"-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）和H2O2构建反应体系，在玻碳电极上修饰DNA3作为免疫传感平台，引入DNA1-Ab1、DNA2-Ab2（DNA1、DNA2、DNA3均有特异性结合部位），当反应体系存在HE4时会与DNA1-Ab1、DNA2-Ab2特异性结合形成三明治结构。基于MoS2NSs和单链DNA特异性结合，开发了一种纳米酶比色传感器，实现了HE4的可视化检测，线性范围为10-6～10ng/mL，检出限为3×10-7ng/mL。

(2)小分子物质的检测

①纳米酶电化学传感器。尿酸在人体内广泛存在，是监测人体健康的重要指标。Hu等将钴单原子锚定在富氮的石墨烯材料上合成了单原子催化剂，用于组装纳米酶电化学仿生传感器检测尿酸，线性范围为0.4～41.95μM，检出限为33.3±0.024nM。Ren等[5]提出了金属有机框架（MOFs）的结构缺陷作为纳米酶催化效率的调节策略，在含钴沸石咪唑骨架中掺杂半胱氨酸（Cys），使材料的比表面积和暴露活性位点增加，类OXD催化活性增强，基于此组装纳米酶电化学传感器可以用于尿酸的灵敏、准确检测，线性范围为200nM～50μM，检出限为67nM。

②纳米酶荧光传感器。Huang等[6]制备了一种基于多酚氧化酶活性的荧光纳米复合物（Pdots@AMP-Cu），可催化底物在668nm处发射红色荧光。AMP-Cu将多巴胺氧化后，导致Pdots@AMP-Cu的荧光淬灭，通过荧光信号的变化实现多巴胺检测，线性范围为10～400μM，检出限为4μM。Jing等[7]合成了类POD活性的荧光铁基金属有机框架复合材料（GOx@NH2-MIL-101），反应体系存在葡萄糖时，GOx@NH2-MIL-101在456nm处的荧光被淬灭，而在565nm处的荧光信号增强，基于此构建纳米酶比率荧光传感器实现对葡萄糖的灵敏、准确、特异荧光检测，线性范围为0.1～600μM，检出限为0.0428μM。

③纳米酶比色传感器。Xu等发现去甲肾上腺素可加速Au-Pd气凝胶胶化，增强Au-Pd气凝胶的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶活性。当存在葡萄糖时，Au-Pd气凝胶可催化葡萄糖反应生成H2O2，随后氧化H2O2释放出·OH，将无色的TMB氧化为蓝色，通过比色法实现葡萄糖的可视化检测，线性范围为30～250μM，检出限为10μM。Doan[8]等通过皂荚（GA）果实提取物制备了一种简单、环保、低成本且具有类POD活性的AgNPs，基于GA-AgNP与H2O2联合氧化TMB建立了纳米酶比色传感器检测H2O2，线性范围为1～8mM，检出限为0.34mM。

(3)重金属离子的检测

①纳米酶荧光传感器。Cu2+是人体内重要的离子之一，当人体内Cu2+过多时，会危害人体健康。Song等将磷化铁嵌入碳基体组成有类OXD活性的二维纳米片（FeP@C），对荧光底物表现出较强类OXD活性。Cys可与自由基结合淬灭荧光，基于Cu2+与Cys强亲和力开发了一种新型纳米酶荧光传感器检测Cu2+，线性范围为0.04～10mM，检出限为0.026mM。Liu等[9]制备了类POD活性的羊毛球状硫化铜（WBLCS），在极低的荧光底物浓度下，Ag+的加入可以显著提高级联体系的性能，故在此基础上利用WBLCS建立纳米酶荧光传感器检测Ag+，线性范围为0.05～75μM，检出限5nM。

②纳米酶比色传感器。Liu等将组氨酸（His）修饰到金纳米团簇上，His通过氨基上的N原子和羧酸基上的O原子与Cu2+配位，与Cu2+表现出很强的亲和力，快速高效捕获Cu2+，基于此构建了纳米酶比色传感器，实现了Cu2+的准确、特异检测，线性范围为1～100nM，检出限为0.1nM。Mao等[10]开发了一种基于单原子纳米酶的比色传感技术，将单原子铁锚定在氮掺杂的石墨烯上形成Fe-N-C结构，增强了单原子铁纳米酶的类POD活性，以TMB作为比色探针，8-羟基喹啉（8-HQ）作为TMB氧化的抑制剂，利用Cr6+和8-HQ的相互作用实现Cr6+的检测，线性范围为30nM～3μM，检出限为3nM。

(4)细菌的检测

①纳米酶电化学传感器。Das等发现AuNPs与铜绿假单胞菌适体（F23）特异性结合会抑制其类POD活性。当铜绿假单胞菌存在时，由于F23与铜绿假单胞菌的亲和力大于AuNPs，F23离开AuNPs表面，使AuNPs的类POD活性恢复，从而实现铜绿假单胞菌的特异性检测，线性范围为60.0～6.0×107CFU/mL，检出限为60.0CFU/mL。Savas等[11]利用羧基化的GQDs与小肠结肠炎耶尔森菌抗体结合，形成抗原-抗体复合物阻碍了GQDs的类POD活性，电化学信号降低，实现了牛奶和血清中小肠结肠炎耶尔森菌的高效检测，检出限分别为5CFU/mL和30CFU/mL。

②纳米酶比色传感器。大肠杆菌O157:H7是一种肠道致病菌，可引起出血性结肠炎、血栓性血小板减少紫癜等疾病。Lu等[12]利用T20控制合成了哑铃样Au-Pt双金属纳米酶，通过将适配体连接的磁性纳米颗粒作为分离抗体，可以有效检出大肠杆菌O157:H7，检出限为2CFU/mL。此外，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可通过纳米酶比色传感器实现精准检测。Zhang等制备了AuNPs功能化的Fe3O4NPs作为纳米酶。在TMB-H2O2传感平台中，金黄色葡萄球菌通过Au-S键屏蔽Fe3O4NPs的催化活性位点，降低紫外可见吸收信号，实现金黄色葡萄球菌的特异检测，线性范围为10～106CFU/mL，检出限为10CFU/mL。

(5)其他蛋白质的检测

①纳米酶荧光传感器。酸性磷酸酶（ACP）广泛存在于人体内，常作为多种疾病的检测指标。Li等[5]基于MOFs材料制备了NH2-MIL-101作为荧光探针和仿生催化剂，在456nm（F456）处发射固有荧光，同时其本身的类POD活性能够催化邻苯二胺（OPD）在556nm（F556）处产生荧光，焦磷酸盐离子（PPi）和NH2-MIL-101的Fe基结合，导致荧光淬灭，引入ACP后，由于ACP水解PPi使NH2-MIL-101恢复催化活性，基于荧光信号比值（F556/F456）的变化构建纳米酶荧光传感器，实现了ACP的定量检测，线性范围为0.01～30U/L，检出限为0.005U/L。

②纳米酶比色传感器。C反应蛋白（CRP）水平异常与高血压、心血管疾病以及细菌和病毒感染等密切相关，因此CRP检测是诊断这些疾病的重要辅助指标。Gupta等[9]采用一锅湿化学法原位合成柠檬酸功能化的纳米粒子（CA@PtRu ANPs），在该免疫测定中，CA@PtRu ANPs充当类POD，胺功能化的二氧化硅涂层磁性微珠（APTES/SiO2@Fe3O4）作为识别CRP的捕获探针，当样本中出现CRP时，形成检测抗体-CRP-捕获抗体的免疫复合物，将无色的TMB氧化为蓝色。在选择性检测CRP过程中线性范围为0.01～180μg/mL，检出限为0.01μg/mL。

纳米酶传感器已经广泛用于生物医学、食品安全、环境监测、细菌检测等领域。但是目前纳米酶传感器在实际应用中仍存在不足，在以下几个方面仍需发展和完善：①目前发现的纳米酶材料多具有氧化还原活性，探究如何开发新的纳米酶活性种类实现更多物质的特异性检测仍有很大的发展空间；
②由于纳米材料的晶化结构和表面构型多样性，纳米酶通常表现出低活性和低稳定性，需进一步寻求新的技术实现纳米酶的高稳定性；
③尽管纳米酶传感器已应用于多种领域，但在人体基因检测方面尚未广泛开展，仍需努力开发此类传感技术。