单细胞测序技术在膀胱癌研究中的应用与展望

郑 越，杨晓峰

（山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原030000）

膀胱癌（bladder cancer,BC）的90%～95% 为尿路上皮癌（urothelial cell carcinoma,UCC），在所有肿瘤中的突变频率中排列第三[1-2]。临床上按照肿瘤浸润膀胱壁深度可以分为非肌层浸润性膀胱癌（non muscular invasive bladder cancer,NMIBC）、肌层浸润性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer,MIBC）。根据分子分型可分为管腔型、基底型和鳞状型[3]。虽然新一代测序技术（next generation sequencing,NGS）已广泛地展示了BC 的基因表达图谱，但这只是肿瘤样本在某一时段的总体批量分析，反映的是整体混合细胞的平均表达谱[3]，掩盖了不同群体细胞的差异特征，忽略了某些基因的随机性表达[4]，从而限制了对BC 机制的深入研究。对于具有高度异质性的BC 细胞，单细胞测序（single cell sequencing,SCS）技术能够从单个细胞水平分析实体肿瘤和体液中细胞亚群、细胞间相互作用，以及网络调控等病理生理的机制，阐述肿瘤内部复杂多样的细胞表型和分化差异，为新的诊疗方案提供理论基础。本文结合SCS 在肿瘤方面的应用，阐述SCS 在BC 中的研究进展。

单细胞RNA（转录组）测序技术（single cell sequencing,scRNA-seq）在2009 年首次出现，开启了SCS 发展的时代[5]。随后的十几年里，相继出现了单细胞DNA（基因组）测序[6]融合DNA-RNA 的多种模式单细胞测序[7]以及采用微流控液滴法，筛选与带有条形码（barcode）、分子标签（unique molecular index,UMI）、引物及酶的凝胶珠（Gel Beads）相结合的单个细胞测序技术，能够在短时间内同时分析数千个单细胞中mRNA 表达和扩增建立文库的单细胞RNA 测序（Drop-seq）[8]。Drop-seq 的出现极大地提高了细胞测序效率，节省了SCS 成本和时间，促使scRNA-seq水平的研究得到了飞跃发展。10X Genomics 是当前最新的SCS 技术，也是在Drop-seq 的基础上，数分钟内就能检测上万的细胞量，扩大了筛选范围，以发掘更多潜在的细胞表型[9]。十多年来，单细胞测序技术不断地创新和发展，并且广泛地应用于mRNA、基因组、染色质、DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色体构像等方面[10]，以应对不同的科研需求。

scRNA-seq 常用于分析转录组中差异基因的表达（differential gene expression,DGE）[11]，比如：动物胚胎发育、组织器官再生和植物细胞发育等生物生理学现象的研究；
神经系统损伤、器官组织疾病、病毒入侵导致的炎症反应和组织细胞改变等病理生理学特征的探讨；
以及癌症组织的起源发展、恶性程度、浸润转移和耐药性机制形成等。

2. 1 单细胞测序技术在BC 发生机制及异质性的应用BC 具有高度的异质性，其形成与肿瘤内异质性（intratumoral heterogeneity,ITH）相关，后者调控着BC 的遗传方向和基因组特征[3]。LI 等[12]关于小鼠正常膀胱上皮细胞scRNA-seq 的研究发现，ASPM基底样细胞群具有增殖更新的能力，能够在受到创伤应激后分化成其他上皮细胞，推测并证实是其他亚群的祖细胞。SANTO 等[13]通过对人类膀胱的scRNAseq 揭示了带有CD49fhigh基底尿路上皮细胞群通过Notch 信号通路实现自我更新和分化潜能的特征，进一步说明基底细胞群是膀胱其他细胞亚群的祖细胞。而人类膀胱癌干细胞（human bladder cancer stem cells,BCSCs）与膀胱上皮干细胞（bladder epithelial stem cells,BESCs）和膀胱上皮非干细胞（bladder cancer non-stem cells,BENSCs）存在转化关系，且ARID1A、GPRC5A 和MLL2 是BCSCs 的 关 键 调 控基因，提示BCSCs 很可能来自BCSC 或BCNSC[14]。

正常膀胱基底细胞存在上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）现象，而T1 期BC 基底细胞中出现的EMT 促进了癌细胞向固有层的浸润[15]。因此，基底细胞的干细胞特性，能够影响上皮细胞和间充质细胞的差异性表达，使得后两者成为BC 发生发展的主要因素，比如：间充质细胞(Acta2+肌成纤维细胞和成纤维细胞)对尿路上皮具有修复和再生作用，可能与癌细胞的增殖有关[16]。一种表达钙黏蛋白12（cadherin 12 ,CDH12）上皮细胞亚群，能够与T 细胞密切作用，高度表达PD-L1、PD-L2 和CD49a，消耗CD+8T 细胞，干预新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NAC)和免疫检查点疗法（immune checkpoint therapy ,ICT），以产生耐药 性[17]。

ZHOU 等[18]通 过 分 析 原 发BC 患 者 的scRNA-seq 数据筛选获得了ITH 相关基因，并对其进行个体化的异质性相关评分，发现高评分中存在GAL-9 低表达和CD+8T 细胞低浸润，是导致免疫治疗反应较差的原因，而低评分中存在免疫调节因子（GPSM3）有关的标志物，与良好的预后相关。

2. 2 单细胞测序技术在BC 免疫微环境中的应用肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment,TIME）包含多种免疫细胞和细胞因子，与肿瘤细胞相互作用，调节肿瘤对免疫应答的反应，其中基质肿瘤浸润淋巴细胞的数量和分布提示肿瘤组织内炎症的发展阶段，并与患者良好的预后相关[19]。有学者认为BC 免疫微环境中同时存在抗肿瘤免疫和肿瘤源性炎性反应，前者即适应性免疫反应，是通过检查点抑制剂（checkpoint inhibitor,CPI）治疗后机体所产生的抗肿瘤反应，所以对CPI 具有敏感性；
后者也称作致瘤性反应，启动细胞间与基质中的固有免疫系统（如：单核吞噬细胞）和成纤维细胞与内皮细胞相互作用，促进肿瘤微环境的形成，进而干扰抗肿瘤免疫和保障肿瘤细胞无限增殖，从而促进耐药性的产生[20]。

CHEN 等[21]对BC 微环境中髓样细胞进行scRNA-seq 测序和拟时序分析，发现其分化亚型单核细胞经历M2 极化，与肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophages,TAMs）存在转化关系；
另一个分化亚型树突状细胞LAMP3+DCs 能够编码细胞因子CCL17 和CCL22 募集调节性T 细胞（regulatory T lymphocyte,Treg），而CD274 则 抑 制CD+8T 的 浸润；
除了免疫细胞，该作者还发现一种炎症性癌症相关成纤维细胞（inflammatory cancer-associated fibroblasts,iCAFs），其致炎作用是通过分泌多种细胞因子（尤其是CXCL12），促进免疫细胞向BC 浸润，推测可能是通过诱导大量Treg 浸润而抑制细胞毒性T 细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的作用。以上表明BC 免疫微环境中的炎性细胞可以转化成为适合肿瘤细胞生长的细胞，可能失去其原始的抗原呈递和清除异常细胞的作用，或者通过调控免疫系统，来抵抗免疫应答对肿瘤细胞的杀伤作用。

令人惊喜的是，OH 等[22]在BC 免疫微环境中首次鉴定出一种细胞毒性CD+4T 细胞，其作用机制是依赖MHC II 类抗原分子识别肿瘤细胞，产生与CTL 功能类似的颗粒酶和穿孔素等裂解靶细胞。正常情况下，机体中的Treg 通过牵制CTL 的数量，使两者处于一种动态平衡的状态，防止出现自身免疫系统疾病。然而BC 癌细胞中Treg 含量远高于CTL，过度抑制CTL 的细胞杀伤作用，因此细胞毒性的CD+4T 的出现，既能作为抗原呈递细胞，又能杀伤靶细胞，并且在肿瘤微环境中富集，可作为BC 免疫治疗很有研究价值的一个靶点。

2. 3 单细胞测序技术在BC 药物治疗中的应用TANAKA 等[23]发现了BC 在应用名为CDDP 的铂基顺铂药物治疗后而产生耐药性基因COX7B，适度的COX7B 表达会降低肿瘤细胞对CDDP 的敏感性，而过度表达却提升对CDDP 的敏感性。KERZELI 等[24]分别对雄性和雌性小鼠建立OH-BBN 诱导的Hgf-Cdk4R24C 尿路上皮肿瘤模型并进行scRNA-seq 分析，发现CPI 治疗对已经存在的癌细胞有效，但是对复发的癌细胞无效，此外还发现CpG-寡脱氧核苷酸仅对雌鼠肿瘤的治疗效果明显。PODOJIL 等[25]发现了一个新的免疫检查点：T 细胞抑制蛋白（B7-H4），不同于高表达于基底表型的CTLA4 和PD-L1 检查点，B7-H4 在管腔和管腔乳头状肿瘤中的表达水平较高，通过诱导CD+4T 细胞和单核细胞而大量产生干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ），增加Foxp3+Treg 的数量，间接调控CD+8T 的数量，而降低了抗肿瘤免疫作用。

LEE 等[26]利用scRNA-seq 分析1 例具有化疗药物耐药性的晚期MIUBC 患者在替比法尼（tipifarnib）治疗前后的癌细胞变化，发现存在具有耐药性的癌细胞亚群通过高表达IGFBP7 和MDK 而抵抗tipifarnib治疗作用，并且在治疗后能够处于相对休眠状态，为后来复发的耐药性癌细胞提供了增殖基础。此外，tipifarnib 能够增强TIME 中的免疫细胞的抗肿瘤应答作用[26]。因此，TIME 在调节免疫治疗方面具有不容忽视的作用。

综上所述，化疗药物和免疫检查点抑制剂常用在BC 的治疗中，但是治疗效果和适用人群都有局限性，原因主要包括：①癌细胞与周围基质相互作用而促进耐药性的产生，降低了治疗的敏感性[27]；
②肿瘤细胞中某种突变基因，可以改变或隐藏自身的治疗靶点，或改变其信号通路，促进其他癌细胞亚型的增殖，因此单一治疗方法不足以应对这些改变[28]；
③免疫细胞对癌组织的浸润太少，使得ICT 治疗受限[29]。因此，利用SCS 阐明癌细胞中的耐药基因和作用机制、发掘更多免疫检查点以及多种途径联合用药已成为当前BC 药物治疗的热点。

2. 4 单细胞测序技术在尿液脱落细胞检测中的应用尿液是与泌尿系统器官中最直接接触的液体，可以包含BC 患者脱落的完整癌细胞、遗传物质、细胞外囊泡和细胞因子，是最适合用于无创性检测BC 中生物标志物的场所。目前，已有多种试剂检测盒获批上市，但其因受假阳性率高、检测结果不稳定、敏感性和特异性较低等因素影响，限制了生物标志物在BC 诊疗中的应用。

通过对BC 患者的尿液脱落细胞（exfoliated tumor cells,ETCs）采 用 单 细 胞DNA 测 序，WANG等[29]发现一种BC 标志物己糖激酶2（hexokinase2,HK2），是尿路上皮癌细胞依赖糖酵解作为能量代谢的一种酶，并且验证了其检测总体敏感性达到90%，总体特异性大于88%。相对于大多数分子检测试剂方法，SCS 既能准确通过尿液中HK2 的检测，筛选处于高糖酵解UETCs（high glycolytic,hgUETCs）的脱落细胞，又能保证较高的敏感性。另一篇报道以同样的方式发现了DNA 拷贝数变异（copy-number variations,CNVs），表明SCS 不仅能鉴定稳定的细胞表型和基因组型，对于频繁突变的基因组也同样有效[30]。

因此，SCS 对BC 患者尿液脱落细胞的检测，不仅能够检测和鉴定尚未发现的罕见癌细胞表型，而且为检测的精准性和稳定性提供了可靠的办法，有望促进生物标志物作为非侵入性和无创性的检测方法，为BC 患者提供更好的诊疗措施。

SCS 在BC 的研究中具有重要的价值：①揭示正常膀胱组织中新发现的细胞表型[31]。②揭示促进BC发生发展的因素，比如：衰老、损伤和炎症导致的疾病[32-33]；
肿瘤干细胞的起源和异质性表达[34-35]。③揭示BC 在早期上皮细胞、复发后肌层浸润和晚期转移等各个阶段的细胞亚群[23]，以及相应的生物标志物[32]和免疫微环境组分。④提示其他组织器官与BC 具有相似的组织特征，可能为BC 的治疗方法提供更多选择[36]。

随着scRNA-seq 技术的不断进步，空间转录组测序技术在scRNA-seq 的基础上，将细胞遗传谱系、基因表达和细胞分化的分析等二维图像数据整合在三维立体空间中，我们既能看到组织的解剖学构象，也能看到所测的细胞类型和关键基因所在的空间定位。这种能够以简明直观的方式让人们迅速发现和理解细胞的发生发展和作用机制，推动了人们对临床标本与分子医学结合应用的展望。

此外，近期有人提出“时空分子医学”的概念，总的来说就是将上述的三维分子医学信息与患者在各个治疗时间点的临床资料（病理学、影像学、解剖学和生化检查等）通过多组学多信息联合分析[37]。这个方案贯穿了个体疾病演进和治疗预后的各个阶段，有助于对前文中提到的高复发率、耐药性和难治性BC 患者的个性化治疗提供新的思路。

当今的医疗体系已逐步向分子医学领域转变，摸清致病机理才能最大限度地发挥预防和治疗作用。SCS 为我们展现了BC 细胞的起源遗传谱系、细胞亚群的差异性分化、细胞间相互作用机制和肿瘤免疫微环境对癌组织的影响，拓展了BC 的治疗方案。经过十几年的演变，SCS 从最初的设想到具有强大功能的实体，再到空间转录组等新兴技术的产生，加快了人类步入个性化精准医疗的时代。