植物乳杆菌发酵草莓果浆工艺优化及抗氧化特性变化

卢世凤，尹琳琳，汪暄妍，茆丽萍

（淮南师范学院 生物工程学院，安徽 淮南 232038）

大多数乳酸菌为人体益生菌，在肠道定植和生长繁殖可抑制致病菌，调节肠道内菌群平衡，具有促进营养物质吸收、提高机体免疫力、降低胆固醇及预防癌症等生理功能［1］。而作为人体补充乳酸菌主要来源的发酵酸乳，被乳糖不耐受、高胆固醇、易致敏及素食主义等消费者群体所难以接受［2］，因此，尝试以果蔬为基质进行乳酸菌发酵已引起人们的广泛关注。植物乳杆菌是一种广泛用于果蔬汁发酵的乳酸菌，大量研究证明其在多种果汁中具有较强的发酵能力，表现出良好的普适性。植物乳杆菌发酵还可促进果蔬汁中酚类等生物活性物质的溶出，能显著提升发酵果蔬汁的抗氧化能力［3］。植物乳杆菌发酵对果蔬汁色泽的劣变有积极的抑制作用，感官评价明显向好［4］。

草莓属小浆果类，酸甜可口，色泽艳丽，多以鲜食为主，但其果质娇嫩，运输困难，常温下仅可保存1～2 d。速冻草莓、草莓果酱、草莓汁等初加工产品，虽然可减少鲜果腐烂浪费，但附加值较低。草莓中富含糖类、有机酸、氨基酸等营养成分，以及多酚、VC等天然抗氧化物质，使其可为乳酸菌发酵提供优良基质［5］。利用酵素、植物乳杆菌等发酵后，发现草莓汁的抗氧化性提升显著，总酚、柠檬酸、L-苹果酸、醋酸和乳酸等代谢产物含量均有提升［6-7］。已有研究主要以草莓清汁为发酵基质，对乳酸菌发酵草莓果浆的相关研究鲜见报道。草莓果浆保留了草莓全部的营养物质，理论上更具发酵优势。有研究发现乳酸菌在苹果果浆中发酵效果显著优于苹果清汁，且发酵后新增大量挥发性风味物质［8］。而对乳酸菌发酵果浆前后主要理化特性及抗氧化特性的研究较少。因此，本文利用植物乳杆菌发酵草莓果浆，以活菌数和感官评分为指标，优化最佳发酵工艺，并分析发酵前后草莓果浆主要理化品质及抗氧化特性变化，为草莓精深加工提供一定依据。

1.1 材料与试剂

草莓购自淮南市水果批发市场；
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）由淮南师范学院生物工程实验中心提供；
抗坏血酸，北京嘉康源科技有限公司；
果胶酶，河南万邦实业有限公司；
福林酚试剂（生物技术级），国药集团化学有限公司；
MRS（Man rogosa sharp）肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；
总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、DPPH（1，1-Diphenyl-2-trinitro-phenylhydrazine）自由基试剂盒，南京建成生物工程研究院。

1.2 仪器与设备

HR2062 PHILIPS搅拌机，飞利浦电子有限公司；
ZSBB-724恒温水槽，上海智城分析仪器制造有限公司；
LDZM-80L-||型立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；
SW-CJ-2D双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；
PHS-3C pH计，上海越平科学仪器制造有限公司；
D-7型紫外可见分光光度计，南京菲勒仪器有限公司；
Z-216-M型小型台式离心机，德国HERMLE；
ZXSD-A1090型生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 草莓果浆的制备 将新鲜草莓去蒂后，用灭菌冷却后去离子水冲洗，按沥水后草莓质量的0.1%添加抗坏血酸，于匀浆机打浆，草莓浆转移至大烧杯，按浆液质量0.05%的比例添加果胶酶，搅拌均匀，用8层纱布封口，置于恒温箱中45℃，保温60 min。冷却后用碳酸氢钠调整果浆的pH值至5.5（根据预实验，发现植物乳杆菌在该酸度条件下发酵效果良好），于恒温水浴锅中80℃，保温20 min以灭酶和杀菌，冷却后于-20℃冷冻，备用。1.3.2 草莓果浆发酵 挑取植物乳杆菌试管斜面菌落，于MRS琼脂平板划线，37℃培养48 h，重复两次。挑取平板菌落1环至50 mL液体MRS中，37℃培养24 h，作草莓果浆发酵种子液用。调整不同接种量接种于4℃融化的草莓果浆，在相应预设条件下静置发酵。

1.3.3 草莓果浆发酵单因素及正交优化试验以发酵草莓果浆中植物乳杆菌活菌数和感官评分为评价指标，分别固定发酵温度37℃、发酵时间18 h、接种量2%，考察发酵温度（28、31、34、37、40℃）、发酵时间（6、10、14、18、22、26 h）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）三个因素变量对草莓果浆的发酵效果影响。根据单因素试验结果，选取发酵温度31、34、37℃，发酵时间14、18、22 h和接种量2%、3%、4%，采用L9（34）正交表，进行植物乳杆菌发酵草莓果浆正交优化试验，因素水平表如表1所示。

表1 正交实验因素水平表L9（34）Tab.1 Factor and level table of orthogonal experiment L9（34）

1.3.4 植物乳杆菌活菌数测定 根据GB 4789.35-2016［9］对草莓果浆中乳酸菌活菌数进行检测。预估草莓果浆中乳酸菌总数，进行10倍梯度稀释，选择2～3个连续的适宜稀释度，吸取1 mL样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个平行试样。倒入约15 mL冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基，转动培养皿混合均匀，冷却后倒置于（36±1）℃培养（72±2）h，进行平板菌落计数。

1.3.5 发酵草莓果浆感官评价 选15名有食品质量与安全专业背景的老师及学生，对发酵草莓果浆从色泽、风味、组织状态和口感几个方面，根据给定评分标准进行评定打分，具体评分标准如表2所示。

表2 植物乳杆菌发酵草莓果浆感官评分标准Tab.2 Sensory evaluation criteria of strawberry pulp fermented by Lactobacillus plantarum

1.3.6 理化指标测定 总酸（以乳酸计）参照GB/T 12456-2008［10］中电位滴定法测定；
总糖参考文献［11］的方法测定；
可溶性固形物采用手持式折光仪法测定；
色差和褐变度参照文献［12］的方法测定；
总酚采用福林酚比色法［13］测定，总酚含量以一水没食子酸当量（Gallic acid equivalent，GAE）计，即mg GAE/mL，一水没食子酸标准溶液（质量浓度为0、1、2、3、4、5、6 mg/mL）制作的标准曲线为y=0.133 3x+0.001 5，R2=0.999；
总黄酮采用Na-NO2-Al（NO）3-NaOH比色法测定［14］，以芦丁标准溶液（质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）制作的标准曲线为y=7.421 2x+0.033 2，R2=0.991。

1.3.7 抗氧化特性测定 DPPH自由基清除活性采用DPPH自由基清除能力试剂盒法测定。首先用甲醇分别配制5、10、15、20、25μg/mL的Trolox标准应用液，然后参照试剂盒程序添加反应体系，混匀后室温静置30 min，517 nm波长下比色，1 cm光径，无水乙醇调零，测定各管吸光度并记录数据。以标准品浓度作为横坐标，自由基清除率作为纵坐标，绘制标准曲线（y=3.1961x+0.941，R2=0.998），计算草莓果浆DPPH自由基清除率。

总抗氧化能力采用总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒法测定，每个样品需要做两支试管，分别为测试管和对照管，向两管中加入1 mL试剂1，加入0.1 mL待测样品在测试管中，分别向两管中加入2 mL试剂2和0.5 mL试剂3应用液，混匀溶液之后37℃水浴30 min，水浴结束后分别向测定管和对照管中加入0.1 mL试剂4，在对照管中加入0.1 mL样品，最后混匀静置10 min，用蒸馏水作为空白管，520 nm波长处测定样品吸光度（A），记录数据并计算。在37℃时，每分钟每mL样品使反应体系的吸光度（A）每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位（U）。

采用SPSS17.0软件进行显著性分析。所有指标测定均重复3次，结果以平均值±标准差表示。

2.1 植物乳杆菌发酵草莓果浆单因素试验结果

2.1.1 发酵温度对草莓果浆活菌数和感官评分的影响 实验结果如图1所示。随着发酵温度的升高，草莓果浆中植物乳杆菌活菌数和感官评分均为先升高后降低。其中，活菌数在37℃时最高，达8.93 lg（CFU/mL）；
感官评分在34℃时最高。温度不适宜时不但抑制该菌生长，同时也造成发酵产品风味品质下降。结合两者整体变化趋势，选取31、34、37℃进行正交优化实验。

图1 发酵温度对草莓果浆活菌数和感官评分的影响Fig.1 Effects of fermentation temperature on viable count and sensory score of strawberry pulp

2.1.2 发酵时间对草莓果浆活菌数和感官评分的影响 实验结果如图2所示。随着发酵时间的延长，草莓果浆中植物乳杆菌活菌数呈上升趋势，在6～18 h区间，活菌数增速较快，18 h后增加缓慢；
感官评分呈现先上升后下降的趋势，在18 h时最高。发酵时间过低，活菌数不足，未呈现明显发酵味，风味单一；
发酵时间高于18 h后，活菌数高，乳酸积累过多不但会抑制植物乳杆菌生长，还会使发酵草莓果浆酸味偏重。综合考虑，选取14、18、22 h进行正交优化实验。

图2 发酵时间度对草莓果浆活菌数和感官评分的影响Fig.2 Effects of fermentation time on viable count and sensory score of strawberry pulp

2.1.3 接种量对草莓果浆活菌数和感官评分的影响 实验结果如图3所示。在接种量1%～5%范围内，草莓果浆中植物乳杆菌活菌数呈持续增加趋势，但在接种量高于3%时，活菌数增加缓慢。这表明接种量过低，植物乳杆菌生长过慢；
接种量过高时，菌体生长快，产乳酸高，会抑制菌体继续生长。在此接种量范围，发酵草莓果浆的感官评分呈先上升后下降的趋势。说明接种量过低时，菌体生长能力弱，可能还会污染杂菌，使草莓果浆感官品质下降，而接种量高时，菌体过快繁殖，乳酸短时积累高，会出现菌体活性衰退、自溶等现象，影响发酵果浆品质。因此，综合考虑，选取接种量2%、3%、4%进行正交优化实验。

图3 接种量对草莓果浆活菌数和感官评分的影响Fig.3 Effects of inoculum size on viable count and sensory score of strawberry pulp

2.2 植物乳杆菌发酵草莓果浆正交优化实验结果

在正交实验中，对植物乳杆菌发酵草莓果浆中活菌数和感官评分进行双指标极差分析和方差分析，结果见表3和表4。对发酵草莓果浆活菌数影响的主次顺序为：A＞C＞B，即发酵温度影响最大，发酵时间次之，接种量影响最小；
对发酵草莓果浆感官评分影响的次序为：C＞B＞A，即发酵时间影响最大，接种量次之，温度最小。

表3 植物乳杆菌发酵草莓果浆正交实验结果及极差分析Tab.3 Orthogonal experiment results and range analysis of strawberry pulp fermented by Lactobacillus plantarum

表4 植物乳杆菌发酵草莓果浆正交实验方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiments of Lactobacillus plantarum fermented strawberry pulp

方差分析结果表明，发酵温度对活菌数影响显著（P＜0.05），发酵时间对感官评分影响显著（P＜0.05），接种量对活菌数和感官评分影响均不显著。选择最优组合为A3B2C3，即发酵温度为37℃，接种量为3%，发酵时间为22 h。由于该组合不在正交实验的设计中，因此对草莓果浆在该组合条件下进行验证实验，结果显示发酵草莓果浆中活菌数为8.83 lg（CFU/mL），感官评分为91分，色泽鲜丽，草莓果香和发酵香味相宜。

2.3 植物乳杆菌发酵前后草莓果浆色度变化

草莓富含丰富的花色苷，赋予其诱人鲜红色，草莓的色泽稳定性是其加工制品中重要评价指标。表5为植物乳杆菌发酵前后草莓果浆的色度和褐变度检测结果。草莓果浆经发酵后，红绿度值降低，红度有一定下降，但不显著；
黄蓝度值增大，黄度呈显著增加；
褐变度和亮度均无显著变化。说明植物乳杆菌发酵草莓果浆对其色泽有所影响，但影响程度较小。无明显褐变现象，因为发酵过程中积累的乳酸等能够抑制褐变［15］。

表5 植物乳杆菌发酵前后草莓果浆色度变化Tab.5 Changes in chromaticity of strawberry pulp before and after fermentation with Lactobacillus plantarum

2.4 植物乳杆菌发酵前后草莓果浆主要理化指标

实验结果如表6所示。植物乳杆菌发酵草莓果浆的总酸（以乳酸计）含量是未发酵草莓果浆的2.5倍，pH值由5.15降至3.65。草莓果浆中约50%的糖类物质被植物乳杆菌消耗，积累了大量酸类物质，使果浆pH值显著下降，呈现出明显的发酵酸味。因为乳酸菌发酵果汁时蔗糖和果糖被消耗，乳酸含量显著增加，而柠檬酸、酒石酸等有机酸降低［6］。

表6 植物乳杆菌发酵前后草莓果浆主要理化指标变化Tab.6 Changes of main physical and chemical indexes of strawberry pulp before and after fermentation with Lactobacillus plantarum

虽然总糖含量下降显著，但发酵草莓果浆的可溶性固形物无明显变化，因为发酵果浆中酸、酚类等物质的增加和溶出会弥补可溶性糖类的消耗［16］。发酵后草莓果浆中的总酚和总黄酮含量均显著升高，一方面是草莓果浆经植物乳杆菌发酵后多酚类物质（大多数黄酮类物质属于多酚类）溶出，另一方面该菌在生长代谢过程中利用果浆中的其他物质合成或转化成多酚类物质所致［7］。

2.5 植物乳杆菌发酵前后草莓果浆抗氧化特性变化

通过对总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力的测定分析草莓果浆发酵前后抗氧化能力的变化，结果见图4。草莓果浆经植物乳杆菌发酵后，总抗氧化能力为未发酵组的2.93倍，DPPH自由基清除能力为未发酵组的1.75倍，与总酚、总黄酮及总酸有的变化趋势相近。这说明植物乳杆菌发酵显著提高草莓果浆的抗氧化能力，且抗氧化能力的提升与活性物质总酚、总黄酮等物质增加有关。这与乳酸菌发酵苹果汁［7］、蓝莓汁［1］等多种果汁研究结果一致。乳酸菌可在发酵过程中产生蛋白酶、葡萄糖苷酶等酶，促进全果汁中与蛋白质、膳食纤维等大分子物质结合态的酚类物质游离出来，乳酸菌通过产生酚酸脱羧酶、糖基水解酶或酯酶将酚类化合物转化为生物活性更高的衍生物［17］。

图4 植物乳杆菌发酵前后草莓果浆抗氧化特性变化Fig.4 Changes of antioxidant properties of strawberry pulp before and after fermentation with Lactobacillus plantarum

利用在果蔬汁乳酸菌发酵中应用较为广泛的植物乳杆菌发酵草莓果浆，以活菌数和感官评分为评价指标，通过单因素和正交优化实验，发现其最佳发酵温度为37℃，接种量为3%，发酵时间为22 h，该条件下草莓果浆中活菌数为8.83 lg（CFU/mL），感官评分可达91分。发酵温度和发酵时间对活菌数和感官评分均有显著性影响，接种量对两者影响均不显著。与未发酵草莓果浆相比，发酵后其色泽稳定，无明显褐变现象，pH值和总糖含量显著下降，可溶性固形物无显著变化，总酸、总酚和总黄酮含量均显著增加。发酵草莓果浆的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力分别提升为未发酵组的2.93倍和1.75倍，这表明草莓果浆基质适宜植物乳杆菌生长，且对草莓果浆的品质具有明显提升作用。未来还需对发酵过程中酶活性、糖类、有机酸及多酚类等活性物质的代谢过程进行深入研究。