皮氏蛾螺黏液粗蛋白对肝癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

于凌慧，赵谭军，陈思梦，李娜，徐静，李春茂，湛垚垚，常亚青*

(1.沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866；

2.大连海洋大学 农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023；

3.大连医科大学 病理学与病理生理学教研室，辽宁 大连116000；
4.大连海洋岛水产集团股份有限公司，辽宁 大连 116500)

皮氏蛾螺VolutharpaampullaceaPerryi 隶属于软体动物门 Mollusca 腹足纲 Gastropoda 新腹足目 Neogastropoda 蛾螺科 Buccinoidea 涡属螺属Mosusogai，自然分布范围比较狭窄，在中国主要分布于黄渤海北部海域[1]。由于皮氏蛾螺的足部与太平洋鲍鱼Haliotisdiscus比较相似，且价格较鲍鱼低廉，因此，在市场上常常被作为鲍鱼的替代品售卖，俗称“假鲍鱼”[2]。近年来，随着对皮氏蛾螺基础生物学研究的不断深入，关于皮氏蛾螺体内活性物质的研究逐渐受到人们的关注。2015年，Wang等[3]研究了皮氏蛾螺的腹足、内脏和性腺组织中多糖的结构和种类，为其营养价值和商业价值提供了参考信息。2017年，孙美玲[4]分离纯化了皮氏蛾螺组织酶解液中两种血管紧张素转化酶(angiotensin convert enzyme，ACE)抑制肽，可作用于ACE达到降血压的效果。2019年，He等[5]从皮氏蛾螺肌肉蛋白酶水解物中获得了一种潜在的能够抑制髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性多肽，在药物和功能性食品的开发中具有应用潜力。2020年，Zhao等[6]研究发现，皮氏蛾螺足部分泌的黏液中富含多种药理成分，是一种具有开发潜力的海洋源生物活性资源。

肝癌(liver cancer)是生存率低、死亡率高的多诱因(病毒、损伤和遗传等)肝脏恶性肿瘤，可分为原发性肝癌和继发性肝癌两大类[7]。据统计，2020年中国原发性肝癌发病率位列国内癌症发病率第五位，而肝癌死亡率则位列中国癌症死亡率的第二位[8]。在肝癌治疗方面，目前中国采取的策略主要包括手术、消融(ablation)、靶向药物、免疫治疗和中药治疗等[9]。虽然这些策略在一定程度上改善了中国肝癌患者的整体预后并降低了肝癌死亡率，但仍存在术后复发、转移和副作用明显等问题，中国肝癌的高发病率和高致死率问题仍十分严峻。因此，寻找新的肝癌治疗靶点，开发靶向性强且安全的新型药物，以及制定更为有效的肝癌治疗方案一直是医学研究的热点和焦点。

本课题组前期研究显示，0.66 g/L(质量浓度，下同)的皮氏蛾螺黏液粗蛋白可显著抑制人肝癌细胞Hep-G2的增殖[6]，但是，粗蛋白抑制人肝癌细胞Hep-G2增殖的具体机制及其是否能在体内发挥抗肿瘤作用等问题，尚未展开研究。本研究中，以人肝癌细胞Hep-G2和H22荷瘤小鼠为研究对象，采用显微观察、流式细胞术和qRT-PCR等技术，分别通过体外和体内试验，分析比较了0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白对Hep-G2细胞的增殖及H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响，以期全面评估和掌握皮氏蛾螺作为海洋源生物活性物质资源的开发潜力，为开发新型海洋源天然抗肝癌药物提供新的线索和参考资料。

1.1 材料

1.1.1 试验动物 试验用野生皮氏蛾螺采自中国辽宁省大连市海洋岛海域(东经123°28′，北纬39°01′)，转运至农业农村部北方海水增养殖重点实验室暂养，用于黏液收集。暂养条件：pH为7.83±0.01，盐度为29.97±0.15，海水温度为(8.37±0.05)℃，溶解氧含量充足，暂养期间不投喂，循环水养殖。

试验用12只雌性Balb/c小鼠体质量为(21±1) g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司(许可证号：SYXK(辽)2018—0007)，于大连医科大学实验动物中心饲养(SPF标准)，适应性饲养一周后开始正式试验。饲养条件：室温为18～22 ℃，湿度为50%～60%，12 h亮-暗交替照明，小鼠自由进食标准饲料和饮用水。

1.1.2 细胞系 人肝癌细胞Hep-G2购于南京凯基生物科技发展有限公司；
小鼠肝癌细胞H22(腹水型)由大连医科大学病理学教研室凌茂英教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 皮氏蛾螺黏液粗蛋白提取 分别提取所收集的皮氏蛾螺黏液的水溶性总蛋白和膜总蛋白(脂溶性蛋白)。

水溶性总蛋白提取方法：将黏液与纯水按照体积比为1∶5置于烧杯中，于磁力搅拌器中4 ℃下搅拌1 h，以10 000 r/min离心 20 min后取上清液，即为水溶性总蛋白。

膜总蛋白提取方法：将黏液与纯水按照体积比为1∶5～1∶10混匀后于冰浴中进行超声破碎，超声破碎20 s间隔 10 s，共进行4个循环，以10 000 r/min离心20 min，弃上清液，利用膜总蛋白提取试剂盒提取膜总蛋白；
将膜总蛋白溶于含有终体积分数为0.02%的TritonX-100水溶液中，得到膜总蛋白溶液。合并所提取的水溶性总蛋白和膜总蛋白溶液，即获得皮氏蛾螺黏液粗蛋白。

1.2.2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白浓度测定 将8 μL皮氏蛾螺黏液粗蛋白与72 μL PBS放入无菌1.5 mL EP管中冰上混合均匀，用量程为20 μL的移液器(德国Eppendorf公司)吸取上述混合液20 μL于干净的96孔板中，重复3个复孔。将A液与B液根据BCA试剂盒(北京赛文创新生物公司)说明书方法配制成工作液。向加有粗蛋白的3个孔中分别加入200 μL BCA工作液，将96孔板于37 ℃恒温箱中避光孵育30 min，用酶标仪(NEO 2，美国BioTek公司)检测波长570 nm处的吸光值，根据标准曲线计算皮氏蛾螺黏液粗蛋白浓度。

1.2.3 细胞形态学观察 取对数生长期的人肝癌细胞Hep-G2接种于直径10 cm的培养皿中，使其汇合度为80%～90%。处理组加入含有0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白的完全MEM培养基(南京凯基公司)，对照组加入完全MEM培养基，继续培养12 h后，于光学显微镜(E100，日本Nikon公司)下观察细胞形态学的变化。吸弃培养液，用体积分数为0.25%的胰酶消化后收集细胞悬液于 5 mL离心管中，以1 000 r/min室温下离心5 min后弃上清液，用PBS清洗2次离心管，并将细胞悬液转移至1.5 mL EP管中，以1 500 r/min室温下离心8 min。弃上清液后，加入1 mL体积分数为2.5%的戊二醛(4 ℃)过夜固定。按照透射电镜(HT7700，日本日立公司)的常规方法制片，观察细胞的超微结构。

1.2.4 流式细胞术 取对数生长期的人肝癌细胞Hep-G2接种于直径10 cm的培养皿中，使其汇合度为80%～90%。接种12 h后，待细胞完全贴壁，处理组以换液形式加入含0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白的培养基，对照组同时换液为完全培养基。培养12 h 后，用体积分数为0.25%的胰酶消化细胞，用PBS清洗2次后4 ℃下固定在体积分数为70%的乙醇中。离心去乙醇，加入碘化丙啶(PI)染液后室温下避光孵育30 min。上机检测前样本经48 μm尼龙筛过滤一次。采用流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)检测，记录激发波长488 nm的红色荧光，计算细胞周期各时相细胞数占比。

1.2.5 qRT-PCR 取对数生长期的人肝癌细胞Hep-G2接种于灭菌6孔板中，待细胞全部贴壁后，处理组加入含有0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白的完全MEM培养基，对照组加入完全培养基，继续培养12 h后，收集对照组和处理组细胞，并按照RNA试剂盒(美国Invitrogen公司，货号15596026)步骤抽提。采用紫外分光光度计(Nanodrop 2000，美国Thermo Fisher公司)测定溶液中的总RNA浓度，定量1 μg，加入5×PrimeScript RT Master Mix(ABM公司) 4 μL，再加无菌水补至20 μL，混合均匀后，按以下程序进行反转录：25 ℃ 10 min、42 ℃ 50 min、85 ℃ 5 min。然后用无菌水将反转录好的 cDNA 稀释10倍后作为模板，利用PCR检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因(CDKN1A/p21)、细胞周期蛋白cyclin B基因(CCNB1)和细胞周期蛋白依赖性激酶基因(CDK1)的mRNA表达水平，同时选β-actin为内参基因，所用引物序列如表1所示。

PCR反应体系(共10 μL)：上、下游引物各0.5 μL，2×Taq酶5 μL，cDNA定量0.5 μg，用ddH2O补足至10 μL。PCR扩增程序：94 ℃下预变性5 min；
94 ℃下循环变性30 s，退火复性30 s(各退火温度见表1)，72 ℃下延伸30 s，共进行32个循环；
最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃或 -20 ℃下保存。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.6 动物体内试验

H22细胞的制备：用无菌PBS调整小鼠肝癌细胞H22浓度为1×108cells/mL的单细胞悬液，按0.2 mL/只腹腔注射4只Balb/c小鼠，5～7 d后无菌操作抽取腹水。将腹水离心去上清液，用无菌PBS洗涤两次，将获得的H22细胞浓度用无菌PBS调整为4×107cells/mL，备用。

H22荷瘤小鼠模型的建立：将上述制备的H22细胞按0.2 mL/只接种于12只Balb/c小鼠右前肢腋下，并记为第0天，24 h后将12只小鼠随机分成3组，每组4只(图1)。每周连续5 d记录小鼠体质量，用游标卡尺测量肿瘤体积并观察小鼠的饮食情况和精神状态。

A—腋下种瘤；
B—预防组给药；
C—模型对照组和治疗组给药；
D—小鼠取样。A—tumor implanted under the armpit; B—prevention groups administered; C—model control and treatment group administered; D—mice treated for sampling.图1 小鼠肝癌细胞H22荷瘤模型的建立和处理示意图Fig.1 Schematic diagram of establishment and treatment of mouse hepatocellular carcinoma H22 transplantation tumor model

分组与给药：

1)模型对照组。至小鼠肿瘤体积为80～100 mm3(第3天)时，每天在肿瘤周围皮下注射30 mg/kg(体质量)的无菌PBS至试验结束(第18天)。

2)预防组。从第1天开始，每天在肿瘤周围皮下注射30 mg/kg(体质量)的皮氏蛾螺黏液粗蛋白至试验结束(第18天)。

3)治疗组。至小鼠肿瘤体积为80～100 mm3(第3天)时，每天在肿瘤周围皮下注射30 mg/kg(体质量)的皮氏蛾螺黏液粗蛋白至试验结束(第18天)。

1.2.7 小鼠体质量和肝脾脏器指标的测定 末次注射粗蛋白24 h后记录各组小鼠体质量，断颈处死小鼠。快速分离肝脏、脾脏等脏器并剥离瘤体，观察肿瘤形态，称重并记录。肝脏(脾脏)指数(%)计算公式为

肝脏(脾脏)指数=脏器质量(g)/小鼠体质量(g)×100%。

(1)

抑瘤率=[对照组平均瘤质量(g)-处理组平均瘤质量(g)]/对照组平均瘤质量(g)×100%。

(2)

1.2.8 小鼠荷瘤生长状态观察 每周连续5 d注射，注射前用游标卡尺测量3组小鼠的肿瘤体积，称量3组小鼠的体质量至试验结束。观察荷瘤小鼠的行为饮食及精神状态。肿瘤体积(mm3)计算公式为

肿瘤体积=0.5×长径(mm)×短径2(mm2)。

(3)

1.2.9 苏木精-伊红(H.E)染色 切取部分瘤体于体积分数4%的多聚甲醛中固定，石蜡切片(HistoCore BIOCUT，德国徕卡公司)，常规H.E染色，在光学显微镜下观察肿瘤组织病理改变情况。

1.3 数据处理

试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用GraphPad Prism Version 6软件(GraphPad Software，美国)对人肝癌细胞Hep-G2细胞周期及其相关基因表达量进行t检验；
采用SPSS 26.0软件对小鼠体质量、肝脾指数、瘤质量、瘤体积进行单因素方差分析，用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2.1 皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理后人肝癌细胞Hep-G2形态学和超微结构的变化

光学显微观察显示，经0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理12 h后，人肝癌细胞Hep-G2的细胞密度明显低于对照组，且细胞形态发生明显变化(图2A)，表现为细胞体皱缩、变圆(图2B)。进一步的细胞超微结构观察发现，与对照组相比，经0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理12 h后，人肝癌细胞Hep-G2的胞质出现空泡，细胞表面微绒毛减少，细胞核浓缩、变形严重，线粒体肿胀，核膜界限模糊(图2D、图2F)。这表明，0.66 g/L的皮氏蛾螺黏液粗蛋白可显著改变人肝癌细胞Hep-G2的形态及超微结构。

A、B为对照组和处理组细胞的光学显微结构；
C、E为对照组细胞超微结构；
D、F为处理组细胞超微结构。黑色箭头示胞体皱缩、变圆(B)，红色箭头示细胞空泡化(D)，白色箭头示核膜(E、F)，蓝色箭头示肿胀的线粒体结构(F)。A and B are the microstructures of the cells in the control and treatment groups under a light microscope；

C and E are the ultrastructures of the cells in the control group；

D and F are the ultrastructures of the cells in the treatment groups. The black arrows show the wrinkling and rounding of the cytosol (B)， the red arrows show the cell vacuolation (D)， the white arrows show the nuclear membrane (E,F) and the blue arrows show the swollen mitochondrial structure (F).图2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理12 h后人肝癌细胞Hep-G2形态学和超微结构的变化Fig.2 Changes in morphology and ultrastructure of human hepatocellular Hep-G2 treated with crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi for 12 h

2.2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对人肝癌细胞Hep-G2细胞周期的影响

采用流式细胞仪,检测了经皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理后的人肝癌细胞Hep-G2在细胞周期各时相(G0/G1期、S期、G2/M期)细胞数量的变化情况。结果显示：对照组人肝癌细胞Hep-G2在G0/G1期和S期的细胞数所占比例分别为(52.20±0.42)%、(20.00±3.82)%，经0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理12 h后，细胞数所占比例分别下降为(43.70±4.95)%、(18.40±0.14)%，且均无显著性差异(P>0.05)；
对照组人肝癌细胞Hep-G2在G2/M期细胞数所占比例为(21.25±0.07)%，经0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理12 h后，细胞数所占比例显著升高至(32.40±1.56)%(P<0.05)(图3)。这表明，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可以阻滞人肝癌细胞Hep-G2的细胞周期于G2/M期。

*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)。

*means significant difference compared with the control (P<0.05).图3 皮氏蛾螺黏液粗蛋白诱导人肝癌细胞Hep-G2 12 h后细胞周期各时相细胞数占比Fig.3 Proportion of cell number in each phase of cell cycle in human hepatoma Hep-G2 cells treated with crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi for 12 h

2.3 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对Hep-G2细胞G2/M期相关基因表达的影响

细胞周期中G2/M期阻滞主要由抑癌蛋白p53、细胞周期蛋白cyclin B与CDK1蛋白复合体介导。本研究中，用qRT-PCR方法检测了p53的下游CDKN1A/p21、CCNB1和CDK1 mRNA表达水平的变化。

qRT-PCR结果显示，经0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理细胞12 h后，人肝癌细胞Hep-G2中CCNB1和CDK1的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，CDKN1A的mRNA表达水平略有上调，但无显著性差异(P>0.05)(图4)。

图(a)中红色虚线表示凝胶的边界。*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)；
**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)。The red dotted line in the figure (a) indicates the boundary of the gel. *means significant difference compared with the control (P<0.05)；
**means very significant difference compared with the control(P<0.01).图4 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对人肝癌细胞Hep-G2的G2/M期相关基因表达的影响Fig.4 Effects of crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi on relative expression of genes related to G2/M phase in cell cycle of human hepatoma Hep-G2 cells

2.4 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠生长的影响

从图5可见：与模型对照组相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组小鼠无自主活动减少现象，一般状况良好，饮食正常；
试验期间，每周连续5 d称量小鼠体质量，至试验结束时，3组荷瘤小鼠体质量较种瘤前分别增加了12.54%(模型对照组)、10.42%(预防组)和14.73%(治疗组)，各组间体质量变化无显著性差异(P>0.05)。这表明，皮氏蛾螺黏液粗蛋白皮下注射对荷瘤小鼠无明显毒副作用。

图5 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠生长的影响Fig.5 Effects of crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi on growth in tumor-bearing mice

2.5 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠脏器指数的影响

从表2可见，3组荷瘤小鼠的肝脏指数无明显差异(P>0.05)，脾脏指数虽无明显差异(P>0.05)，但注射粗蛋白组较模型对照组略有升高，提示皮下注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白可改善荷瘤小鼠的免疫力，对荷瘤小鼠脏器无明显药物毒性。

表2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠脏器指数的影响(n=12)Tab.2 Effects of crude protein from the mucus of whelk Volutharpa ampullacea Perryi on organ indices of tumor-bearing mice(n=12)

2.6 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

从图6(a)可见：与模型对照组相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组小鼠肿瘤体积明显减小；
模型对照组的肿瘤形状多为不规则圆形，而皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组的肿瘤形状多为不规则扁平。

标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.图6 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响Fig.6 Effects of crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi on tumor growth in tumor-bearing mice

从图6(b)可见：预防组和治疗组肿瘤质量分别为(0.69±0.18)、(0.5±0.12)g，二者均极显著低于模型对照组(P<0.01)，模型对照组肿瘤质量为(0.87±0.08)g。

从图6(c)可见：与模型对照组相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组的肿瘤生长速度明显缓慢；
从种瘤后第10天开始，粗蛋白注射组的肿瘤体积与模型对照组出现差异；
至试验结束时，预防组和治疗组肿瘤体积分别为(1 619.51±17.58)、(1 437.11±311.81)mm3，二者均显著低于模型对照组(P<0.05)，模型对照组肿瘤体积为(2 563.55±565.46)mm3。

从图6(d)可见：预防组和治疗组最终抑瘤率分别为20.75%和42.94%。这表明，皮氏蛾螺黏液粗蛋白皮下注射可显著抑制荷瘤小鼠体内的肿瘤生长。

2.7 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白对小鼠肿瘤组织病理变化的影响

小鼠养殖试验结束后，断颈处死小鼠剥离瘤体，观察发现，在其他组织器官未发现肿瘤转移。

H.E染色结果显示，模型对照组小鼠的肿瘤组织中细胞较为完整、分布密集，而皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组的小鼠肿瘤组织中出现片状坏死灶，肿瘤组织疏松，细胞间隙明显变大，且伴随不同程度的核固缩(图7)，这进一步证实了30 mg/kg的皮氏蛾螺黏液粗蛋白皮下注射在小鼠体内具有一定抗肿瘤作用。

A—模型对照组；
B—预防组；
C—治疗组。黑色箭头所示为肿瘤组织中的坏死灶。A—model control group; B—prevention group; C—therapy group. The black arrow shows the necrotic foci in the tumor tissue.图7 荷瘤小鼠肿瘤组织的H.E染色结果Fig.7 H.E staining results of mouse tumor tissues in each group

3.1 皮氏蛾螺黏液粗蛋白对人肝癌细胞Hep-G2形态及超微结构的影响

海洋源生物活性物质具有降血压、抗炎、抗血栓和抗肿瘤等生物活性[10]，在开发与利用方面一直是海洋生物学和药物学研究领域的热点和焦点。比如，从海洋被囊动物Aplidiumalbicans中提取的脱氢膜海鞘素(aplidin)，可通过作用于破骨细胞前体和成熟的破骨细胞，抑制骨吸收，发挥抗骨髓瘤的生物活性作用[11]；
从海洋无脊椎动物Arcasubcrenata体内分离出的一种小分子肽H3，可显著抑制人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞Hep-G2和人结肠癌细胞HT-29的增殖，具有抗肿瘤和抗氧化的生物活性作用[12]；
从海洋海绵Ceratopsionsp.中提取的细胞毒性肽Yaku’amides A，可抑制癌细胞株JFCR39生长，现已进入临床试验阶段[13]。本课题组前期研究发现，皮氏蛾螺黏液含有较为丰富的药理学成分，其粗蛋白可显著抑制人肝癌细胞Hep-G2的增殖[6]。本研究中，在前期研究基础上，首先通过显微观察发现，经0.66 g/L的皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理后，Hep-G2细胞的形态和超显微结构均发生了显著改变，这与张旭等[14]发现的苏木素(hematoxylin)诱导膀胱癌细胞T24凋亡的显微观察结果具有一定的相似性。这表明，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可通过改变人肝癌细胞Hep-G2的结构，进而影响其亚细胞器发挥正常生理功能，最终导致细胞增殖受阻。

3.2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白诱导人肝癌细胞Hep-G2阻滞于G2/M期

细胞周期阻滞(cell cycle arrest)、细胞凋亡(apoptosis)、细胞自噬(autophagy)和细胞坏死是导致细胞增殖受阻的重要原因。其中，细胞周期阻滞被认为是抑制细胞增殖的经典因素。本研究中发现，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理组人肝癌细胞Hep-G2中处于G2/M期的细胞比例显著高于未经处理的对照组，由于G2/M检查点(checkpoints)是防止有DNA损伤的细胞进入细胞分裂期的最后关卡[15]，笔者由此推测，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能通过影响G2/M期的核心蛋白或复合物而发挥抑制癌细胞增殖的作用。研究显示，细胞周期蛋白cyclin B在细胞有丝分裂中扮演着重要角色，其缺乏可导致细胞周期G2/M期的延长[16]，细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1在细胞周期G2/M期发挥检查点作用，协调推动细胞周期进程[17]。此外，CDK1依赖于cyclin B而活化，并与其结合形成cyclin B/CDK1复合物，该复合物被证实是G2/M期的核心复合物，直接影响细胞周期的进程[15]。本研究中qRT-PCR结果显示，与未经处理的对照组相比，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理组人肝癌细胞Hep-G2中的CCNB1和CDK1的mRNA表达水平均呈现显著下调趋势，这一结果与蓝萼甲素(glaucocalyxin A)通过cyclin B1/CDK1途径诱导人前列腺癌细胞DU145阻滞于G2/M期的研究结果具有一定的相似之处[18]，同时，也进一步证实笔者的推测。此外，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理组人肝癌细胞Hep-G2CDKN1A/p21的mRNA表达水平较未处理的对照组有轻微上升，因此推测，由细胞周期蛋白激酶抑制剂CDKN1A介导的CCNB1和CDK1的相对表达下调，可能是皮氏蛾螺黏液粗蛋白导致Hep-G2细胞无法完成由G2/M期向G1过渡进而阻滞于G2/M期的重要机制。当然，仅从转录水平结果判断皮氏蛾螺黏液粗蛋白在体外抑制人肝癌细胞Hep-G2增殖的机制仍不十分全面，在后续的研究中，应从蛋白表达水平进一步验证皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能通过影响G2/M期的核心蛋白或复合物而发挥抑制癌细胞增殖的作用。同时，应系统研究皮氏蛾螺黏液粗蛋白是通过哪些细胞信号转导通路诱导了人肝癌细胞Hep-G2的G2/M期阻滞。

3.3 皮氏蛾螺黏液粗蛋白抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的效果

动物试验是研究生物活性物质功能、药物筛选及研发的经典手段和常规方法。本研究中，通过建立移植瘤小鼠模型以进一步验证皮氏蛾螺黏液粗蛋白在体内是否具有抗肿瘤功效。研究表明，相较于雄性小鼠而言，雌性H22腹水型肝癌小鼠的生存期更长，耐受性更好[19]。因此，本研究中体内试验的研究对象为雌性小鼠，但皮氏蛾螺黏液粗蛋白对雄性H22荷瘤小鼠的影响仍需进一步研究。本研究结果显示，与模型对照组相比，在连续3周(每周5次)皮下注射试验中，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组(30 mg/kg)小鼠的存活率、体质量及肝脏指数均无明显差异，但是，脾脏指数略有升高。由于脾脏为机体重要的周围免疫器官，因此，脾脏增大反映出免疫细胞的积累[20]。此外，通过改善癌症患者免疫细胞的免疫抑制作用，可以达到对抗肿瘤的目的[21]，这表明免疫细胞在抵抗肿瘤的发生发展中发挥了重要作用。因此，本研究中一方面证实皮氏蛾螺黏液粗蛋白对荷瘤小鼠并无显著的副反应发生，另一方面也表明，皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能通过改善荷瘤小鼠的免疫力发挥抑制肿瘤生长的作用。除此之外，与模型对照组相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组小鼠肿瘤生长速度、肿瘤质量和肿瘤体积显著低于模型对照组，且治疗组的体内抗肿瘤生长效果优于预防组，推测可能是由于预防组在种瘤次日开始治疗，此时注射的肿瘤细胞悬液尚未完全形成肿瘤结节，因此，皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能主要在肿瘤中晚期进程发挥抑制肿瘤生长作用，但相关调控机制仍需进一步深入研究。此外，本研究中移植瘤切片的H.E染色结果发现，与模型对照组相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组的小鼠瘤体中均出现不同程度的片状坏死灶，这一结果与黄芪总皂苷联合顺铂(cisplatin)抑制荷瘤小鼠生长的处理组中肿瘤组织形态改变的结果具有一定的相似之处[22]，这可能是由于肿瘤内部供血不足造成的组织缺血，而肿瘤中的新血管生成在肿瘤生长、进展和转移中发挥重要作用[23]，这表明皮氏蛾螺黏液粗蛋白抗肿瘤的作用可能与抑制新血管生成相关。基于以上研究结果，仍需进一步从分子水平探索皮氏蛾螺黏液粗蛋白抑制肿瘤生长的机制，是否与小鼠性别、免疫力改善、成瘤的不同阶段及抑制新生血管形成相关，还应继续挖掘皮氏蛾螺黏液粗蛋白抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的不同信号通路。

综上所述，皮氏蛾螺黏液粗蛋白在体内和体外试验中均可抑制肝癌细胞的增殖，这表明皮氏蛾螺足部分泌的黏液具有作为海洋源生物活性物质资源的开发潜力，未来有望为新型海洋源天然抗肝癌药物研发提供新的线索和参考资料。

1)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可显著改变人肝癌细胞Hep-G2的形态及超微结构，从而阻滞细胞周期，抑制肝癌细胞增殖。

2)初步推测体外试验潜在分子机制是：0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白有可能通过抑制细胞周期相关基因CCNB1和CDK1表达，从而诱导人肝癌细胞Hep-G2阻滞于G2/M期。

3)通过皮下注射30 mg/kg皮氏蛾螺黏液粗蛋白，可显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长且无不良反应，为肝癌的防治提供了新的线索和参考资料。