外泌体转运miR-324-5p对胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响

高正兴， 赵琳

(北京市大兴区人民医院体检中心，北京市 102600)

手术是胃癌治疗的首选方法，但治疗期间的辅助化疗，具有靶向性差、不良反应多等缺点[1]。外泌体是具有双层脂质膜结构的细胞外囊泡，直径40～100 nm，可转运多种生物活性物质，并参与细胞间信号传导[2]。在肿瘤微环境中，癌细胞分泌的外泌体和miRNAs可以被其他细胞内化，在外泌体中穿梭并传递给受体细胞，从而介导基因表达[3]。因此，与目标miRNA相结合的治疗可能是治疗耐药肿瘤的一个方向[4]。miR-324-5p在胃癌组织中呈差异性表达，并参与胃癌的恶性进展[5]。同时，miR-324-5p在肝癌、结肠癌等多种癌症中均表达降低，并参与细胞生长调控[6]。目前尚无外泌体转运miR-324-5p对胃癌小鼠移植瘤生长的研究。本研究探讨了外泌体转运miR-324-5p对胃癌小鼠移植瘤生长的影响，为外泌体转运miR-324-5p治疗胃癌提供理论依据。

1.1 材料

人胃癌细胞株MGC-803(上海通派公司)，RPIM-1640培养液和胎牛血清(美国Hyclone公司)，Exo-quick-TC exosomes外泌体提取试剂盒(上海兰兴公司)，PKH26试剂盒(美国Sigma公司)，Cy3-miR-324-5p mimic(5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-3′)和Lipofect转染试剂盒(北京天根试剂公司)，细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent protein kinase inhibitor 1A,p21)、β-actin、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)和HRP标记山羊抗鼠二抗(美国Santa Cruz公司)，BIO-RAD ChemiDocTM成像系统(美国BIO-RAD公司)，TRIzol试剂盒、MTT、细胞凋亡检测试剂盒(美国Amresco公司)。雌性BALB/c-nu裸鼠30只[(苏州斯莱克生物公司，动物合格证号为SXCK(苏)2020-0001]，体质量(22±1.27) g，SPF级，6～8周龄。

1.2 细胞培养和外泌体提取

取对数生长期MGC-803细胞于无血清培养基培养，48 h收集上清并离心30 min(2 000 r/min)，去除细胞碎片并过滤，将Exo-quick-TC exosomes外泌体提取以1∶5的比例加入过滤液中，混匀，4 ℃过夜；
离心，弃上清，管壁白色沉淀即为外泌体。将沉淀溶于磷酸盐缓冲液中，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，调整质量浓度为100 mg/L，得到外泌体，-80 ℃保存备用。

1.3 外泌体转运miR-324-5p mimic的制备

取质量浓度为200 mg/L Cy3-miR-324-5p mimic溶于1.2提取的外泌体混悬液中，定容至1 mL，在恒温培养箱中孵育1 h(37 ℃)，离心10 min(3 000 r/min)，用孔径0.22 μm过滤器进行过滤后离心120 min(12 000 r/min，4 ℃)，弃上清，将沉淀溶于100 μL磷酸盐缓冲液中得到外泌体转运miR-324-5p mimic混悬液。

1.4 MGC-803细胞摄取外泌体检测

向外泌体混悬液和外泌体转运miR-324-5p mimic混悬液加入4 μL PKH26稀释液，混匀后静置3 min，用磷酸盐缓冲液终止染色，用孔径0.22 μm过滤器进行过滤后离心120 min(2 000 r/min，4 ℃)，将沉淀溶于磷酸盐缓冲液中得到PKH26标记的外泌体和PKH67标记的外泌体转运miR-324-5p mimic。取对数生长期MGC-803细胞，接种于96孔板中，待细胞融合后分别加入PKH26标记的外泌体和PKH67标记的外泌体转运miR-324-5p mimic，24 h后，调整细胞为1×106个/mL，37 ℃ DiO染色10 min，离心弃上清，观察细胞摄取情况。摄取效率(%)=转染阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 细胞分组

实验分为对照组、外泌体组和miR-324-5p mimic组。对照组细胞不进行处理，外泌体组加入外泌体混悬液，miR-324-5p mimic组加入外泌体转运miR-324-5p mimic混悬液。

1.6 MTT法检测细胞增殖率

按1.5分组方法处理细胞，44 h后加入MTT(50 μL/孔)，后加入二甲基亚砜，甲醛经固定后0.1%结晶紫液染色30 min，用酶标仪检测各孔OD值。细胞增殖率(%)=(实验组OD值-空白孔OD值)/(空白对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.7 流式细胞法检测细胞凋亡率

按1.5分组方法处理细胞，48 h后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，用Annexin V Binding Solution(1×)调整细胞为1×106/mL。一次性加入5 μL Annexin V-FITC与碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 移植瘤模型建立

按1.5分组方法处理MGC-803细胞，在每只裸鼠左腋下注射0.2 mL细胞悬液(1×108个/mL)，每组3只，第20天处死大鼠，分离瘤体，对瘤体进行称重，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-实验组/对照组)×100%。

1.9 qRT-PCR检测瘤体中miR-324-5p、p21、CyclinD1和LC3 mRNA的表达

取部分冻存的瘤体组织，制成匀浆，加入1 mL TRIzol进行总RNA提取，根据mRNA反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒说明书严格进行试验，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司)：miR-324-5p F：5′-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3，R：5′-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3′；
p21 F：5′-GAGTTCTCACTTTCATCTGTT-3′，R：5′-TGTCCGATCTACTTTC CC-3′；
CyclinD1 F：5′-TCCGACCGGCCTTTCAAGCAG-3′，R：5′-GAGAACCTGACCAGAACTCCCAG-3′；
LC3 F：5′-AAACGCATTTGCCATCACAGT-3′，R：5′-GTGAGG ACTTTGGGTGTGGTTC-3′；
GAPDH F：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3，R：5′-AGTCTTCTGGGTGGCA GTGAT-3′。U6作为内参。

1.10 Western blotting检测蛋白表达

瘤体组织加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解(30 min)离心取上清，进行电泳(20 μg/孔)，蛋白质经8%SDS-PAGE分离后转移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶封闭，将膜与p21、CyclinD1和LC3抗体进行孵育，过夜(4 ℃)，洗膜后与相应的HRP标记山羊抗鼠二抗孵育30 min，使用增强化学发光试剂盒显色，用BIO-RAD ChemiDocTM成像系统进行光密度定量，β-actin为内对照。

1.11 统计分析

2.1 MGC-803细胞摄取外泌体效率

外泌体组、miR-324-5p mimic组MGC-803细胞摄取外泌体效率分别为(60.3±1.2)%和(57.4±1.1)%(图1)。

图1 MGC-803细胞摄取外泌体效率(DiO染色,400×)

2.2 外泌体转运miR-324-5p mimic对MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

与对照组和外泌体组比较，miR-324-5p mimic组MGC-803细胞增殖率降低，凋亡率增加(P<0.05；
表1和图2)。

表1 外泌体转运miR-324-5p mimic对MGC-803细胞增殖、凋亡的影响

图2 外泌体转运miR-324-5p mimic对MGC-803细胞增殖、凋亡的影响A为细胞增殖图(结晶紫染色，400×);B为细胞凋亡图。

2.3 外泌体转运miR-324-5p mimic对移植瘤质量和抑瘤率的影响

与对照组和外泌体组比较，miR-324-5p mimic组裸鼠移植瘤质量降低、抑瘤率增加(P<0.05；
表2)。

表2 外泌体转运miR-324-5p mimic对移植瘤质量和抑瘤率的影响(n=3)

2.4 外泌体转运miR-324-5p mimic对移植瘤miR-324-5p、p21、CyclinD1、LC3 mRNA及蛋白的影响

与对照组和外泌体组比较，miR-324-5p mimic组裸鼠移植瘤中CyclinD1 mRNA与蛋白降低，miR-324-5p、p21、LC3 mRNA与p21、LC3蛋白增加(P<0.05；
表3和图3)。

表3 外泌体转运miR-324-5p mimic对移植瘤miR-324-5p、p21、CyclinD1和LC3 mRNA的影响(n=3)

图3 外泌体转运miR-324-5p mimic对移植瘤中p21、CyclinD1和LC3蛋白的影响a为P<0.05，与对照组比较；
b为P<0.05，与外泌体组比较。

目前，关于胃癌的发病机制尚不明确，由于其高发病率和高死亡率，当务之急是寻找积极有效的治疗方法[7]。有研究表明，肿瘤来源的外泌体能传递细胞间信号，能与靶细胞结合其所携带的生物分子经胞吞方式被接收，从而释放到靶细胞内并发挥作用[8]。外泌体具有极强的癌细胞亲和力，能够靶向性选择癌细胞，是新型的纳米级药物运输载体[9]。外泌体对miRNA具有高选择性，可由生物工程途径将外泌体携带的miRNA转移至靶细胞，具有靶向治疗潜力[10]。目前，外泌体已成功将小干扰RNA、miRNA及紫杉醇等药物转运至靶细胞[4]。

研究表明，miR-324-5p是肿瘤细胞发育的关键调节因子，参与癌细胞的增殖、侵袭[11]。肿瘤细胞来源外泌体可参与肿瘤进展，外泌体转运miR-324-5p后可通过与相应抗体结合从而激活靶细胞，在体外抗肿瘤中具有明显效果[12]。肝癌细胞中，高表达miR-324-5p导致癌细胞侵袭性和转移性降低，抑制miR-324-5p时肝癌细胞侵袭性增强[13]。p21基因是一种细胞周期抑制因子，与细胞衰老有关[14]。由于p21在细胞周期调控中的核心作用，p21被认为是一种真正的肿瘤抑制因子，p21在其N末端结合细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)4/6、CDK2和CDK1[15]。为了实现CDK抑制，p21必须同时与Cyclin和CDKs结合，而p21水平依赖于p53，p21介导p53依赖的G1期阻滞，以应对发生在S期的DNA损伤[16]。因此p53/p21可能在细胞周期凋亡中具有重要作用。p21是p53的一个已知靶点，与多种Cyclin-CDK复合物相互作用以控制细胞周期进程。本研究制备外泌体转运miR-324-5p mimic载体，经MGC-803细胞摄取，结果显示，外泌体转运miR-324-5p mimic能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。本研究结果显示，外泌体转运miR-324-5p mimic可提高移植瘤miR-324-5p和p21 mRNA及蛋白水平，降低CyclinD1 mRNA及蛋白水平，减缓移植瘤生长。提示外泌体转运miR-324-5p可能在胃癌肿瘤细胞增殖和凋亡中发挥重要作用，其研究可能对胃癌靶向治疗具有重要意义。

受各类因素影响，胃癌患者初次诊断时已进入进展期并存在淋巴结转移与浸润等[17]。胃癌发生转移的初始表现为自噬紊乱，LC3是自噬体形成的关键蛋白，通过抑制或耗尽上游复合物，将减少自噬体的数量，促进细胞凋亡[18]。本研究结果显示，外泌体转运miR-324-5p mimic后可以提高移植瘤组织中LC3 mRNA水平，表明外泌体转运miR-324-5p对于肿瘤细胞自噬和凋亡具促进作用。研究发现，miR-324-5p和Mtfr1在心肌细胞凋亡和心肌梗死过程中具有互补的表达模式[19]，提示miR-324-5p可通过下调Mtfr1抑制线粒体分裂、凋亡，这与本研究结果相似。然而，miR-324-5p的作用通路比较复杂，对移植瘤的影响机制还不明确，本研究将在后续深入分析。

综上所述，外泌体转运miR-324-5p能抑制胃癌小鼠移植瘤细胞增殖和促进凋亡，其可能是通过对p21和LC3表达上调和CyclinD1表达下调，从而促进细胞自噬，降低移植瘤质量。