基于SSR标记的莴苣品种鉴定体系的建立及应用

凌 晨，赵 洪，颜 军，马莹雪，冯艳芳， 张靖立，李 波，邓 超，徐振江

(1.华南农业大学 农学院，广东 广州 510642；
2.农业农村部科技发展中心，北京 100122；

3.农业农村部植物新品种测试(上海)分中心，上海 201415；
4.上海市农业科学院 农产品质量标准 与检测技术研究所，上海 201403；
5.衡阳市蔬菜研究所，湖南 衡阳 421001；
6.北京市农林科学院，北京 100097)

莴苣(LactucasativaL.)是菊科莴苣属植物，染色体数为2n=18。栽培莴苣按产品器官分为叶用莴苣和茎用莴苣。叶用莴苣在世界范围内广泛种植，按叶的生长形态可分为散叶莴苣、半结球莴苣和结球莴苣[1]。茎用莴苣是叶用莴苣传入我国后经过多年选择培育逐渐演变而来的特色莴苣类型[2]，主要在我国种植。我国是莴苣主产国之一，近10 a莴苣产量占全球产量1/2以上[3]。我国茎用莴苣种质资源较丰富，多为地方品种，叶用莴苣种质资源多从国外引进，早期育种家多以表型特征对莴苣命名，不同科研单位或公司可能重复从国外引种并加以不同命名，加上国内各地区频繁引种，导致莴苣种质资源混杂和亲缘关系混乱[4]，存在“一品多名”和“同名异种”情况，给莴苣种质资源收集鉴定、品种选育和市场监管等带来困难，有必要建立莴苣品种快速精准的鉴定技术体系。

目前，常用的品种鉴定方法包括形态学标记法(表型)和DNA分子标记法[5]。相比形态学标记，分子标记耗时短、成本低，不受环境、地域和季节影响，是品种快速鉴定常用方法之一。SSR标记具有多态性好、共显性遗传、平台通用性好、数据统计较简单、易于标准化等优点，是我国农业行业标准《植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则》(NY/T 2594—2016)品种分子鉴定的主要推荐标记之一[6]。

SSR分子标记技术在莴苣种质资源评价和品种鉴定中已有广泛应用。梁照文等[7]开发出了9个SSR标记，用于对野生莴苣及其近似种的分类鉴定及遗传多样性分析；
Hong等[8]利用58个SSR标记对叶用莴苣品种和野生莴苣进行鉴定和分类；
魏仕伟等[5]利用22个SSR标记对27个叶用莴苣进行品种鉴定。此外，SSR标记在亲缘关系分析和起源探究[9]、遗传图谱构建[10]、基因定位和分子标记辅助选择[11]等也有应用。前人研究报道大多针对叶用莴苣，将SSR分子标记同时应用于叶用莴苣和茎用莴苣的研究鲜有报道，亦未见建立基于SSR标记的莴苣品种鉴定体系的报道。基于高通量检测平台的品种鉴定体系要求核心引物具有多态性高，等位变异易于区分，数据易于统计，重复性好，染色体分布情况清楚，在基因组上均匀分布等特点[6]；
为大批量样品检测，提高检测效率，最好具有多重扩增或多重电泳的潜力。

本试验在前人研究基础上，利用荧光毛细管电泳平台筛选出一套符合品种鉴定体系要求，可通用于叶用莴苣和茎用莴苣的SSR引物，并以此构建莴苣品种的指纹数据库，旨在为莴苣品种的快速鉴定、遗传多样性分析及莴苣品种DUS测试辅助筛选近似品种提供技术支持。

1.1 试验材料

233个供试莴苣品种详见表1，其中1～85号由北京市农林科学院提供，86～149号由国家园艺种质资源库-北京蔬菜分库(国家蔬菜种质资源中期库)提供，150～186号由上海市农业生物基因中心提供，187～219号由农业农村部植物新品种保藏中心提供，220～233号由农业农村部植物新品种测试(上海)分中心提供。233个供试品种中同名品种共24个(8组)，均为茎用莴苣。

表1 233个供试莴苣品种信息Tab.1 Information of 233 lettuce varieties used in this study

表1(续)

1.2 SSR引物

从相关文献[5，7-8，12-19]中挑选出245对SSR引物，用于高多态性引物的初步筛选，在初筛出的引物上游5′端按扩增产物片段大小标记荧光染料(6-FAM、HEX、ROX或TAMRA)。普通引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，荧光引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 DNA提取

每个品种取15～20株幼苗嫩叶片，用改良CTAB法[20]提取DNA，用微量分光光度计和1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，原液-80 ℃保存，工作液-20 ℃保存。

1.4 PCR扩增

PCR反应体系20 μL，其中DNA(浓度50 ng/μL)2 μL，上下游引物(浓度0.25 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，超纯水7 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5 扩增产物检测

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：PCR产物用8% PAGE，80 W电泳1.0～1.5 h，银染、拍照保存。荧光毛细管电泳检测：PCR产物视不同荧光染料稀释50～100倍，毛细管电泳体系为10 μL，其中稀释过的PCR扩增产物1 μL，分子内标(LIZ 500)0.1 μL，去离子甲酰胺8.9 μL，振荡混匀、离心，95 ℃变性5 min，冷却后瞬时离心，DNA分析仪(ABI3730)分型，依据分子内标在SSR指纹分析器中校准，读取数据。

1.6 田间种植对比鉴定

在农业农村部植物新品种测试(上海)分中心测试基地对分子上未能区分的品种进行1个生长周期的田间种植对比鉴定。试验设计：2020年11月初发芽箱恒温恒湿催芽，穴盆育苗，大棚栽培，栽培地前茬种植辣椒。每个品种种植小区面积12 m2，小区宽畦高垄平行种植，畦面带沟宽1.45 m，每个畦面种植3行，株行距35 cm×40 cm，设2个重复，每个品种种植不少于60株。视植株生长情况定时定量滴灌浇水，田间管理参照大田生产。莴苣生长过程中底肥施复合肥，追肥施尿素和复合肥。定期施药，包括联苯肼酯、苯醚甲环唑、绿妃、吡虫啉、噻菌铜、嘧霉异菌脲、嘧菌脂、烯酰晴霜唑、银法利、灭蝇胺等防治蚜虫、霜霉病、灰霉病、软腐病、白粉病、枯萎病等病虫害，不同时期视植株生长情况及病虫害发生情况混合不同药液对植株进行叶面喷施。测试性状和测试方法：参照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 莴苣》(NY/T 2559—2014)(以下简称莴苣测试指南)[21]，根据不同性状观测要求，选取具有代表性的植株进行测量记录，按照分级范围转换成代码进行性状分析。

1.7 数据分析

利用Powermarker v3.25软件[22]分析品种的遗传多样性，计算各引物的PIC值、等位基因数；
用MEGA 4.0软件[23]构建基于品种间Nei′s遗传距离的UPGMA聚类图。

2.1 引物初筛

从233个莴苣品中选出挂丝红莴笋(No.87)、紫皮莴苣(No.90)、尖叶莴笋(No.89)、碧玉生菜(No.86)、库斯托(No.216)、KNV000226(No.150)、绿珊瑚(No.224)和伊赛斯(No.193)等8个形态差异大、不同类型的莴苣品种用于引物初筛。245对引物通过PCR扩增以及8% PAGE分析，初筛出81对扩增稳定、多态性较高、带型较清晰的引物。图1为引物a～c的电泳结果，引物c扩增不稳定；
引物b多态性较低；
引物a多态性较高，扩增稳定，带型较清晰，选为初筛引物。按照此标准，从245对引物中选出81对初筛引物，进入复筛。

M.DNA分子量标准；
1—8.挂丝红莴笋、紫皮莴苣、尖叶莴笋、 碧玉生菜、库斯托、KNV000226、绿珊瑚、伊赛斯。

M.DNA Marker；
1—8.Guasihongwosun，Zipiwoju，Jianyewosun， Biyushengcai，Kusituo，KNV000226，Lüshanhu，Yisaisi.

2.2 引物复筛

对81对初筛引物添加荧光标记，对90个莴苣品种进行PCR扩增，毛细管电泳检测，复筛出41对多态性高、扩增稳定、峰形信息易读取、重复性好的荧光引物。图2为引物SML-015(No. WJS2)[21]和引物LSSB48[6]在耐寒二白皮中检测到的等位基因，前者检测到的峰形信息容易读取，后者检测到的峰形信息较难读取。依据峰型读取难易程度，二者比较优先选择引物SML-015。根据各引物在染色体上分布情况、区分率等，从41对复筛引物中进一步筛选出22对核心引物，22对核心引物较为均匀地分布在9条染色体上(表2)。22对核心引物为最优核心引物数量，从剩余19对复筛引物中选择增加引物，不能进一步提高区分率。

图2 引物SML-015(A)和LSSB48(B)在耐寒二白皮中检测到的等位基因Fig.2 Alleles detected in Naihanerbaipi using primer SML-015(A)and LSSB48(B)

2.3 莴苣品种鉴定体系的建立

利用22对核心引物采集233个莴苣品种的指纹数据，22对核心引物在233个莴苣品种中共检测到269个等位基因，每对引物检测到等位基因为4～22个，平均为12.23个，其中引物LSE-79(No.WJS16)[17]、LSE-83(No.WJS17)[17]、LSSA28-1(No.WJS21)[19]检测到等位基因数最多(均为22个)。22对核心引物PIC值为0.37～0.89，平均为0.73，其中引物WSULs153(No.WJS4)[13]、LSE-79(No.WJS16)[17]、LSSA28-1(No.WJS21)[19]的PIC值最高(均为0.89)。统计22对核心引物等位基因，为不同引物的不同等位基因命名并选择相应的参照样品(表2)，用于矫正或消除系统误差，保证指纹数据的准确性。

表2 22对核心引物及其等位基因的参照样品Tab.2 22 core primers and reference samples for each allelic variation

表2(续)

2.4 莴苣品种遗传多样性分析

利用Powermarker软件分析品种的遗传多样性，各品种间遗传相似系数在0～1.000，平均为0.746。聚类分析结果如图3所示，233个供试莴苣品种分为两大类群：G1类群包含96个品种，主要为茎用莴苣(90个)，少部分为叶用莴苣(散叶莴苣5个，半结球莴苣1个)；
G2类群包含137个品种，叶用莴苣132个(散叶莴苣47个，半结球莴苣57个，结球莴苣28个)，少部分为茎用莴苣(5个)。G2类群的叶用莴苣中，结球莴苣趋于聚成一类，半结球莴苣趋于聚成一类，但相比结球莴苣较分散，散叶莴苣难以聚成一类。

2.5 分子标记无差异品种的田间鉴定

田间表型鉴定是植物品种身份鉴定最直接的鉴定方式，也是品种身份的最终鉴定方式。22对核心引物未能区分的品种共6组15个品种(图3)，第1组：红运当头(No.187)、红剑(No.209)、红脆(No.211)、飞桥莴苣(No.223)；
第2组：翡翠香莴(No.191)、武青一号(No.220)、澳立青(No.227)；
第3组：KNV000246(No.162)、KNV000247(No.176)；
第4组：布莱克柔丝(No.203)、KAY010(No.214)；
第5组：红叶笋(No.101)、紫叶笋(No.104)；
第6组：伊赛斯(No.193)、四季白尖叶(No.217)。其中红叶笋和紫叶笋在株高(50 cm/40 cm)、叶面褶皱(微皱/多皱)2个性状上有明显差异，伊赛斯和四季白尖叶为不同类型莴苣，均不需安排田间表型鉴定。将其他4组品种进行田间种植对比试验，按照莴苣测试指南对30个基本性状进行观测。结果表明，第1组品种中，飞桥莴苣和红脆在数量性状肉质茎长度和假质量性状肉质茎肉色中存在代码差异，但均未达到明显差异水平，判定为相同品种；
二者与红剑在数量性状肉质茎长度上有明显差异，与红运当头在数量性状肉质茎长度和抽薹始期、假质量性状肉质茎形状上有明显差异；
红运当头和红剑在假质量性状肉质茎形状上有明显差异。第2组品种武青一号和澳立青在30个性状中均无明显差异，判定为相同品种；
二者与翡翠香莴在数量性状植株株幅和抽薹始期上有明显差异。第3组品种KNV000246和KNV000247在30个性状中均无明显差异，判定为相同品种。第4组品种布莱克柔丝和KAY010在质量性状叶片叶脉和叶姿态(10～12片期)、叶姿态(商品收获期)、叶片泡状程度、叶片边缘波状程度等4个数量性状、叶形状和叶先端形状等2个假质量性状上有明显差异。田间鉴定结果表明，有3组品种表型田间鉴定无明显差异，判定为相同品种，有3组品种表型田间鉴定无明显差异，判定为相同品种，大部分分子标记无差异品种在30个测试性状中无明显差异(表型相同)，或仅有2～3个数量性状/假质量性状有明显差异(表型近似)。本试验供试莴苣实际品种数量为230个，22对核心引物能将230个品种中的220个区分开，实际区分率为 95.7%。表3为第1组4个品种的表型性状。

红色.茎用莴苣；
绿色.散叶莴苣；
黄色.半结球莴苣；
蓝色.结球莴苣；
●.遗传相似系数为1的品种。

Red.Stem lettuce；
Green.Looseleaf lettuce；
Yellow.Half-hitch lettuce；
Blue.Crisphead lettuce；
●.Varieties with genetic similarity coefficient of 1.

表3 4个高遗传相似度莴苣品种表型性状对比Tab.3 Morphological characteristics of 4 lettuce varieties with high genetic similarity

表3(续)

2.6 同名品种鉴定分析

22对核心引物可以将233个供试莴苣品种中的8组、24个同名品种(表1)区分开，品种间遗传距离为0.046～0.922，平均为0.616。聚类结果显示(图4)，8组同名莴苣品种可分为4个类群，第Ⅰ类群仅有1个源于新疆的品种(圆叶笋)；
第Ⅱ类群有9个品种，包括所有来源于湖南和河北的4个品种，4个华东地区的品种及1个陕西的品种，圆叶紫莴笋(No.88)和圆叶紫莴苣(No.110)这组同名品种在此类群；
第Ⅲ类群有5个品种，来源于四川的4个品种均在此类群，包括红莴笋(No.91)、红莴笋(No.95)和红莴笋(No.135)这组同名品种；
第Ⅳ类群有9个品种，包括5个西北地区的品种和2个山西的品种。结果表明，这8组同名品种为具有相同名字的不同品种，遗传多样性较高；
聚类结果与地理来源有一定相关性，来源于同一省份或地区的品种大多被划分到同一类群。

标注相同颜色的品种为同名品种。

Varieties marked with the same color are the varieties of the same name.

3.1 SSR引物多态性和品种区分能力评价

本研究筛选的22对SSR核心引物较均匀地分布于莴苣的9条染色体，在233个莴苣品种中均能有效扩增。每对引物平均检测到的等位基因数量高于Hong等[8](3个等位基因)、魏仕伟等[5](8.31个等位基因)的研究结果。PIC值高于Hong等[8]的0.425，略低于魏仕伟等[5]的0.75。魏仕伟等[5]研究的供试材料为叶用莴苣，本研究的供试材料包括叶用莴苣和茎用莴苣，茎用莴苣遗传多态性相比叶用莴苣低，这可能是导致本研究引物PIC值较之略低的原因。本研究筛选的22对核心引物满足《植物品种鉴定 DNA 分子标记法 总则》(NY/T 2549—2016)[6]中 95% 区分率的要求，引物对品种区分能力较强，可有效用于莴苣品种快速鉴定。

3.2 莴苣品种遗传多样性评价

本研究利用22对SSR核心引物对233个莴苣品种进行遗传多样性分析，划分为茎用莴苣和叶用莴苣两大类群，基于Nei′s遗传距离的莴苣品种聚类结果与基于形态学性状的品种归类基本一致。与前人[12，24]研究结果相似，都未能通过分子标记完全划分茎用莴苣和叶用莴苣两大类，但划分效果相比Simko[12]更好。叶用莴苣遗传多样性高于茎用莴苣，散叶莴苣难以聚成一类，散叶莴苣遗传多样性高于其他叶用莴苣类型，结球莴苣遗传多样性低于其他叶用莴苣类型，此结果与前人研究结果一致[5，12，19，24-25]。

3.3 综合利用分子标记和表型进行种质资源和品种鉴定

本研究利用22对SSR核心引物能将潜在的“同种异名”(遗传相似系数为1)品种聚到一起，也能将8组“同名异种”莴苣有效区分，将此套引物应用到莴苣种质资源收集鉴定中，一方面可以避免资源的重复收集，另一方面可以避免优异种质资源特别是同名地方品种的漏选，提高资源收集保藏和鉴定的效率和效果。本研究基于荧光毛细管电泳平台建立，并且根据各引物扩增产物片段大小和荧光标记将22对引物分为5组，能大幅提高检测效率，降低检测成本，适用于种质资源和品种的批量鉴定和分子指纹库构建。

品种是根据实际表达出的表型性状进行定义的，SSR标记通常位于基因组的非转录区，被认为是“中性”标记，不具备明显的生物学功能[26]，因此，通过分子标记并不能鉴定所有品种，特别是对于突变体和遗传背景狭窄的品种，有时难以通过分子标记进行区分[27]。本研究的233个品种中，有6组、15个品种不能通过分子标记区分，但其中有9个品种可以通过品种描述或田间种植对比加以区分，说明在品种鉴定中，应该采取分子标记结合表型的方式，达到提高效率和确保科学的统一。SSR分子标记虽然与表型(生物学功能)没有直接联系，但总体上分子遗传距离较近的品种，其表型性状也较为相近。本研究6组、15个分子距离为0的品种中，有3组共6个品种表型无明显差异，同组表型无明显差异的品种被判定为相同品种；
表型有明显差异的品种间，存在差异性状的数量较少，性状表达差异的程度也总体较小，说明此套分子标记可作为DUS测试辅助筛选近似品种的一种手段。

本研究筛选出22对多态性高、可通用于叶用莴苣和茎用莴苣，适用于我国莴苣品种鉴定等优点的莴苣核心引物。依据扩增片段大小为各引物选择了相应的参照样品，并建立了莴苣品种鉴定体系，依据莴苣品种鉴定体系构建233个莴苣品种的指纹数据库。可应用于莴苣品种的快速鉴定及辅助DUS测试筛选近似品种。