我国新出现的禽副黏病毒14,型基因组特性

克军宏，王静静，于晓慧，邢安琪，3，彭真奇，4，陈 伟，刘华雷

（1.塔里木大学，新疆阿拉尔 843300；
2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；
3.宁夏大学，宁夏银川 750021；
4.安徽农业大学，安徽合肥 230036）

禽副黏病毒（avian paramyxovirus，APMV）在分类地位上属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒亚科，主要包括3 个病毒属，即正禽腮腺炎病毒属、副禽腮腺炎病毒属和偏禽腮腺炎病毒属[1]。目前已鉴定的APMV 至少包括21 种血清型，分别为APMV-1～21。其中，APMV-1、APMV-9、APMV-12、APMV-13、APMV-16～19 和APMV-21 属于正禽腮腺炎病毒属，APMV-2、APMV-5～8、APMV-10、APMV-11、APMV-14、APMV-15 和APMV-20 属于偏禽腮腺炎病毒属，APMV-3 和APMV-4 属于副禽腮腺炎病毒属。APMV 是一种有囊膜的单股负链RNA 病毒，基因组长为1.3 万～1.7 万核苷酸（nucleotide，nt），可感染多种野鸟和家禽[1]。APMV-1～9 出现于20 世纪80 年代前，2005—2015 年又在多种野鸟和企鹅中陆续分离到APMV-10～21[2-12]，其中2011 年在日本野鸭中首次分离到APMV-14[8]，至2021 年未见有关分离到APMV-14 毒株的其他报道。目前，我国流行的APMV 主要为APMV-1，即新城疫病毒[13]。近年来，在我国家禽和野鸟中也分离到APMV-2、APMV-4和APMV-6 等毒株[14-16]。2022 年，在我国福建省鸡群和江西省鸭群中各分离到1 株APMV-14。为了解我国家禽中APMV-14 分离株的基因组特性，本研究对2 株APMV-14 分离株进行了基因组测序和序列分析，以期为APMV-14 生物学特性等相关研究奠定基础。

1.1 病毒

chicken/Fujian/1013/2022（FJ1013）和duck/Jiangxi/1232/2022（JX1232），均在新城疫监测中被分离到，分别分离自福建省和江西省活禽市场采集的临床健康家禽口咽/泄殖腔拭子样品，由中国动物卫生与流行学中心禽病监测室保存。

1.2 病毒繁殖

将病毒液经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚（购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司），0.2 mL/枚，每个样品接种5 枚鸡胚；
接种后37 ℃条件下孵育，18 h 后每12 h 照胚1 次，记录鸡胚死亡情况；
收集18 h 后的死胚及96 h 仍存活鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，并测定病毒血凝（HA）效价。

1.3 RNA 提取和病毒基因组扩增

利 用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒核酸，立即用于RT-PCR 扩增或置-20 ℃保存备用。按照Primescript One Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa）说明书配置反应体系，分段扩增病毒基因组序列，基因组扩增引物见表1。利用SMARTer RACE 5"/3"试剂盒（Clontech）扩增病毒基因组5"和3"末端。RT-PCR 产物送青岛睿博兴科生物科技有限公司测序。

表1 APMV-14 基因组扩增引物

1.4 序列分析

利用Lasergene 软件拼接和编辑基因组序列，分析病毒基因组结构和基因组核苷酸序列同源性，利用MEGA 软件分析F、HN 蛋白关键氨基酸位点。

1.5 遗传进化分析

从GenBank 中下载APMV-1～21 代表株序列，利用MEGA 软件进行遗传进化分析，采用邻位相连法（neighbor-joining）构建基因组遗传进化树，bootstrap 设置为1 000 次重复。

2.1 APMV-14 分离株信息

2022 年从我国福建省鸡群和江西省鸭群各分离到1 株APMV-14，2 株毒株均可在鸡胚中有效复制。病毒相关信息见表2。

表2 APMV-14 分离株基本信息

2.2 基因组序列分析

2 株毒株基因组长度均为15 444 nt，基因组结构均为3"-N-P-M-F-HN-L-5"，遵循“六碱基原则”；
分离株3"前导序列和5"尾随序列长度均分别为55 和277 nt，N、P、M、F和HN基 因5" 非转录区（untranslated region，UTR）均长于3"UTR，L基因3"UTR 长于5"UTR，基因间隔区（intergenic sequence，IGS）长度为2～36 nt（表3）；
各基因起始序列较保守，只有1 个碱基差异，终止序列存在1～3 nt 的差异（表4）。2 株毒株F蛋白长度为541 个氨基酸（amino acid，aa），与日本分离株11OG0352 一致，F 蛋白裂解位点为99REGR ↓L103，具有低致病性禽副黏病毒的典型分子特征；
F 蛋白有5 个潜在N-糖基化位点，分别位于73、180、433、457 和483 位；
HN 蛋白长度均为607 aa，长于日本分离株11OG0352（580 aa）；
HN 蛋白有7 个潜在N-糖基化位点，分别位于119、148、278、346、377、390 和584 位。

表3 APMV-14 分离株基因组长度特征

表4 基因起始序列和基因终止序列

2.3 基因组核苷酸同源性分析

从GenBank 中下载APMV-1～21 代表株各1株（表5），与我国分离的2 株APMV-14 进行基因组核苷酸序列同源性分析。结果（表6、图1）显示：我国分离的2 株毒株高度同源（99.5%），与APMV-14 代表株基因组同源性最高（91.0%），与其6 个基因片段同源性为87.7%～92.0%；
2 株分离株与APMV-3 同源性最低（45.0%），与其余APMV 的核苷酸同源性为45.3%～52.3%。

图1 基因组核苷酸序列同源性分析结果

表5 APMV 代表株信息

表6 分离株6 个基因片段与APMV-14 代表株的核苷酸同源性 单位：%

2.4 遗传进化分析

病毒基因组遗传进化分析结果显示，我国分离的2 株毒株与日本分离株（11OG0352）位于同一分支，均属于APMV-14 型（图2）。

图2 基因组遗传进化树

野鸟被认为是禽流感病毒、新城疫病毒等多种禽病病毒的贮存宿主。近年来，从野鸟中也分离到多种APMV[1，17-18]，其中全球首株APMV-14 毒株分离自日本野鸭粪便样本[8]。从我国福建省和江西省分离的2 株APMV-14 毒株均来自家禽；
但由于缺乏野鸟APMV-14 监测数据，暂不清楚我国家禽中APMV-14 的确切来源。目前，全球主要有8 条候鸟迁徙路线，其中3 条从我国经过，分别为东非—西亚迁徙线、中亚—印度迁徙线和东亚—澳大利亚迁徙线，每年从我国过境的候鸟种类和数量约占迁徙候鸟的20%～25%[19]。福建省和江西省具有良好的生态环境和丰富的湿地资源，每年冬春季节都会吸引大量湿地水鸟前来越冬。湿地水鸟的大量迁徙可能会增加其与家禽接触的机会，进而导致APMV-14 传播。因此，建议加强养殖场的生物安全管理，避免野鸟与家禽接触。

APMV-14 为单股负链RNA 病毒，基因组由6个基因片段（N、P、M、F、HN、L）组成。本研究中的2 株毒株基因组长度均为15 444 nt，与日本分离株11OG0352 相同[8]。虽然我国分离的2 株毒株与日本APMV-14 分离株（11OG0352）属于同一进化分支，但基因组核苷酸同源性仅为91.0%，且存在多处氨基酸差异。我国分离的2 株毒株F蛋白裂解位点序列为REGR ↓L，与日本分离株11OG0352 存在1 个氨基酸差异（REGK ↓L）；
HN 蛋白长度为607 aa，明显长于日本分离株（580 aa）[8]。研究[20]显示，APMV-1 HN 蛋白的长度与病毒毒力相关；
而HN 蛋白长度是否会影响病毒的生物学特性，还需进一步研究。

2011 年在日本野鸭粪便样本中首次分离到APMV-14 后，10 年内未见有分离到APMV-14 毒株的其他报道。2022 年，中国动物卫生与流行学中心禽病监测室分别于鸭和鸡的口咽/泄殖腔拭子样品中分离到2 株APMV-14 毒株。这2 株毒株虽然宿主来源不同，但基因组核苷酸序列同源性高达99.5%，说明APMV-14 已具备从水禽跨种传播至陆禽的能力。据推测，在分离到这2 株毒株之前，我国野生水鸟和家禽中可能就已存在APMV-14 流行。因此，今后还需要加强野鸟和家禽的APMV-14 监测及其跨种传播机制研究。