藏药大花龙胆抗氧化活性成分筛选与鉴定

张国英 耿丹丹 迟晓峰

1.青海省药品检验检测院，青海 西宁 810016；
2.国家药品监督管理局中药(藏药)质量控制重点实验室，青海 西宁 810016；
3.青海省中藏药现代化研究重点实验室，青海 西宁 810016；
4.河北医科大学基础医学院，河北 石家庄 050017；
5.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008

上呼吸道感染为鼻腔、咽部和喉部炎症的总称，包括普通感冒、流行性感冒、咽炎等，其主要由多病毒(如鼻病毒、流感病毒、冠状病毒和腺病毒等)感染引起[1]。由于上呼吸道感染中巨噬细胞的异常激活和细胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)信号密切相关，而病毒感染和缺氧引起细胞损伤的机制也和活性氧堆积引起氧化性损伤有关，因此，在常规治疗中常辅以抗氧化剂进行治疗[2]。研究[3]发现，抗氧化剂可能通过抑制ROS信号依赖的巨噬细胞过度活化、预防缺氧性组织损伤以及减少病毒带来的细胞损伤。因此，发掘临床上应用的治疗上呼吸道感染的中藏药材中的天然抗氧化活性成分，有望对上呼吸道感染产生理想的辅助治疗作用，为临床治疗提供新的思路。

长期以来，国内中药效应物质基础研究的主流模式主要是在化学成分提取、分离和结构鉴定基础上利用药理模型对得到的纯化合物进行生物活性测试。这样的研究方法阐明了一些中药的效应物质基础，然而该方法费时费力，且原药材用量较大[19]。近年来，国内外有不少学者建立了中药药效物质基础的生物活性筛选-色谱在线分析方法(如抗氧化剂[20]、乙酰胆碱酯酶抑制剂[21]、α-葡萄糖苷酶抑制剂[22]等)，能够使效应成分的分离与筛选相结合，克服以往先从中药中分离单体或有效部位，再分析其药效，致使成分分离与效应筛选脱节的弊端，大大提高了天然植物活性化合物筛选和鉴定的效率。

基于此，本研究采用HPLC-DPPH-MS/MS在线抗氧化活性筛选体系，对大花龙胆中的抗氧化活性成分进行快速筛选与鉴定，以期为揭示藏药大花龙胆的活性物质基础提供基础数据。

1.1 主要仪器 本研究所用主要的仪器包括Agilent 1100 HPLC-MSD液相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)；
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；
AG135型精密电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；
KQ-100E型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；
优普UPE-Ⅱ-40 L型超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)；
IKA旋转蒸发仪(德国IKA公司)；
定比分流阀(美国IDEX Health &Science 公司)；
NP7000半制备色谱色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)；
Varian INOVA 600M 核磁共振谱仪(美国Varian公司)。

1.2 主要药品与试剂 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批号：STBD4148V)购于德国Sigma公司；
甲醇(色谱纯)购自德国Merck公司；
冰乙酸(分析纯)购自天津百世化工有限公司。二丁基羟基甲苯(BHT，批号：BCBN2001V)购于德国Sigma公司；
维生素C(批号：100296-201104)购于中国食品药品检定研究院；
实验用水为超纯水。

大花龙胆采自青海省玉树藏族自治州称多县(N 97.57°；
E 34.01°)，由中国科学院西北高原生物研究所迟晓峰副研究员鉴定为大花龙胆(GentianaszechenyiiKanitz)，大花龙胆标本保存于中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆(HNWP)。

2.1 实验条件 本实验采用实验室自建HPLC-DPPH-MS/MS抗氧化活性在线筛选体系(如图1所示)开展抗氧化活性成分筛选测试。具体流程为样品提取液经HPLC(1)的色谱柱分离，流出液通过定比分流阀被分成大小两部分，小流速部分(0.2 mL/min)进入二极管阵列检测器(DAD)检测；
大流速部分(0.8 mL/min)进入PEEK混合池，与HPLC(2)泵入的DPPH自由基溶液混合，样品中的抗氧化活性成分与DPPH自由基溶液反应后进入紫外检测器(UV)，在517 nm下进行在线检测。由于抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用造成的其在517 nm下吸收值降低而形成的负峰，对比DAD检测器获得的色谱图与UV检测器得到的负峰色谱图，筛选出具有抗氧化活性的化合物，通过MS/MS数据对活性化合物进行鉴定。

图1 HPLC-DPPH-MS/MS抗氧化活性在线筛选体系

HPLC(1)工作条件：色谱柱，Dikma Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
流动相，0.1%冰乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；
梯度洗脱，0～60 min，10%～55% B；
柱温，30 ℃；
流速，1.0 mL/min；
检测波长254 nm；
进样量,10 μL。质谱工作条件：离子源，电喷雾 ESI，负离子电离模式；
雾化气：N2；
雾化气压力：40 psi；
干燥气体流速：9 L/min；
干燥气体温度：325 ℃。

HPLC(2)工作条件:反应环，PEEK反应池(15 m×0.25 mm，江苏汉邦科技有限公司)；
流动相：DPPH甲醇溶液，0.40 mL/min流速等度洗脱；
检测波长517 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 DPPH溶液的配制 称取DPPH粉末适量，精密称定(0.0001 g)，配置成浓度为25.0 μg/mL的甲醇溶液。置于4 ℃冰箱中保存，待用。

2.2.2 供试品溶液的配制 称取干燥的大花龙胆药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称重，超声处理1 h，用甲醇补足失重，0.45 μm滤膜过滤，备用。

2.3 抗氧化活性物质在线筛选 按“2.1”项下筛选条件，对大花龙胆花提取液进行在线抗氧化筛选，所得色谱图如图2所示。从图2中可以看出，快速筛选出共5个主要的抗氧化活性成分。经质谱检测，5个化合物的分子离子峰及碎片信息见表1。经与文献比对，化合物1鉴定为为异荭草素[23]，化合物2鉴定为异金雀花素[24]，其结构式如图3，其余3个化合物通过质谱信息未得到鉴定。

图2 大花龙胆花在线抗氧化筛选色谱图

表1 化合物1～5的质谱数据

2.4 抗氧化活性物质分离鉴定 采用半制备液相色谱对化合物3、4、5进行分离纯化。制备色谱条件参照“2.1”项下色谱条件，并线性放大。制备色谱柱型号为Megres C18(10 mm×250 mm,5 μm)；
流动相：0.1%冰乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；
梯度洗脱：0～60 min，10%～55% B；
柱温：30 ℃；
流速：4.7 mL/min；
检测波长254 nm；
进样量：0.2 mL。在此条件下分离制备得到化合物3(3.59 mg)、化合物4 (2.4 mg)、化合物5 (25.8 mg)，HPLC检测纯度均大于98%。利用美国Varian INOVA 600M 核磁共振谱仪获得其1H-NMR和13C-NMR 数据，并对其进行结构解析。

化合物3：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.57(1H,s,H-3),7.29(1H,dd,J=1.8 Hz,8.4 Hz,H-6′),7.03(1H,dd,J=1.2 Hz,7.8 Hz,H-4′),6.77(1H,t,J=7.8 Hz,H-5′),5.37(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),5.37(3H,d,J=7.8 Hz,OMe),5.27(1H,d,J=4.8 Hz，H-1),4.52(1H,d,J=4.8 Hz,1-glc-1),3.64,3.69(2H×2,m,1-glc-6),3.46(1H,q-like,J=6.7 Hz,H-5),3.15(1H×2,m,1-glc-5),3.14(1H×2,m,1-glc-3),3.05(1H×2,m,1-glc-4),2.98(1H×2,m,1-glc-2),2.35(1H,dd,J=7.8 Hz,13.8 Hz,H-9)，2.15(1H,m,H-8),2.15,1.86(1H,m,H-6),1.06(1H,d,J=6.6 Hz,H-10)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.1(C-7′),165.1(C-11),152.4(C-3),149.6(C-2′),146.1(C-3′),120.8(C-4′),119.5(C-6′),119.0(C-5′),113.1(C-1′),110.4(C-4),98.9(1-O-glc-1),95.8(C-1),94.0(glc-1),78.125(C-7),77.8(glc-5),77.3(1-glc-5),76.7(glc-3),76.4(1-glc-3),73.1(1-glc-2),72.4(glc-2),70.0(1-glc-4),69.4(glc-4),61.2(1-glc-6),60.4(glc-6),45.1(C-9),39.9(C-8),38.8(C-6),31.0(C-5),13.3(C-10)。以上数据结合文献[25]报道确定化合物3为乌奴龙胆苷E。

化合物4：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.49(1H,s,H-3),7.22(1H,dd,J=1.5 Hz,8.0 Hz,H-6″),7.02(1H,dd,J=1.5 Hz,7.8 Hz,H-4″),6.74(1H,dd,J=7.8 Hz,8.0 Hz,H-5″),5.73 (1H,ddd,J=17.5,10.6,8.3 Hz,H-8)，5.51(1H,d,J=7.0 Hz,H-1),5.34 (1H,brd,J=17.5 Hz,H-10),5.24 (1H,brd,J=10.6 Hz,H-10),4.53(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),4.25-4.3 (1H,m,H-7),3.55(3H,s,OMe),3.42,3.67(1H,m,H-6′),3.14 (1H×2,m,H-3′,H-5′),3.01 (1H,m,H-4′),2.95(1H,m,H-2′),2.86 (1H,q-like,J=6.4 Hz,H-6),2.62 (1H,q-like,J=6.8 Hz,H-9),1.87,2.00 (1H,m,H-6)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.4(C-7″),166.6(C-11),152.2(C-3),149.5(C-2″),146.0(C-3″),134.5(C-8),120.7(C-4″),119.5(C-6″),119.1(C-10),118.8(C-5″),113.0(C-1″),109.4(C-4),98.7(C-1′),95.6(C-1),77.3(C-5′),76.6(C-3′),73.0(C-2′),70.0(C-4′),63.7(C-7),61.2(C-6′),51.0(OMe),43.1(C-9),29.0(C-5),28.7(C-6)。以上数据结合文献[26]报道确定化合物4为为大花龙胆苷B。

化合物5：白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:7.46 (1H,s,H-3′),7.41(1H,s,H-3),7.03(1H,dd,J=1.3,7.8 Hz,H-4″),6.75(1H,t,J=7.9 Hz,H-5″),5.68(1H,ddd,J=8.4,10.8,18 Hz H-8′),5.48(1H,d,J=7.0 Hz,H-1′),5.34(1H,t,J=4.8 Hz H-7),5.24(1H,d,J=4.8 Hz,H-1),5.17,5.28(2H,brd,J=10.6,17.4 Hz,H-10′),4.52(1H×2,d,J=4.8 Hz,1-glc-1,1′-glc-1),4.26,4.35(2H,m,H-7′),3.41,3.67(2H×2,m,glc-6),3.14(1H×2,m,glc-3),3.14(1H×2,m,glc-5),3.04(1H,m,J=8.5Hz,H-5),3.01(1H×2,m,glc-4),2.94(1H×2,m,glc-2),2.56 (1H,q-like,J=7.2 Hz,H-9′),2.77(1H,q-like,J=6.6 Hz,H-5′),2.32(1H,q-like,J=7.8 Hz,H-9),2.15 (1H,m,H-8),2.15,1.82 (1H,m,H-6),1.74,2.05(2H,m,H-6′),1.06 (1H,d,J=7.2 Hz,H-10)。

13C-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ:169.1(C-7″),166.6(C-11),166.6(C-11′) 152.1(C-3′),151.0(C-3),149.7(C-2″),146.1(C-3″),134.6(C-8′),120.8(C-4″),119.5(C-6″),119.0(C-10′),118.8(C-5″),113.1(C-1″),111.1(C-4),109.6(C-4′),98.7(1-glc-1),98.7(1′-glc-1),95.6(C-1),95.6(C-1′),78.2(C-7),77.3(1′-glc-5),77.3(1-glc-5),76.6(1-glc-1),76.6 (1′-glc-1),73.1 (1-glc-2),73.1 (1′-glc-2),70.0 (1-glc-4),70.0 (1′-glc-4),62.0 (C-7′),61.2(1-glc-6),61.2(1′-glc-6),51.1(OMe),45.1(C-9),43.1(C-9″),39.9(C-8),38.8(C-6),31.1(C-5′),29.8(C-5),29.0(C-6′),13.3(C-10)。以上数据结合文献[25]报道确定化合物5为乌奴龙胆苷A。

化合物3、4、5的化学结构如图3所示。

图3 化合物1～5的化学结构图A.异荭草素；
B.异金雀花素；
C.乌奴龙胆苷E；
D.大花龙胆苷B；
E.乌奴龙胆苷A

2.5 抗氧化活性测试 采用DPPH比色法测定上述5个化合物的抗氧化活性。分别精密称定BHT、维生素C对照品以及异荭草素、异金雀花素、乌奴龙胆苷E、大花龙胆苷B和乌奴龙胆苷A的纯度大于98%自制品约1 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，待用。分别取上述对照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、2 mL于具塞试管中，用甲醇稀释至2 mL，摇匀。得到5种不同浓度的供试品溶液。精密吸取0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL与2 mL供试品溶液于一具塞试管中震荡摇匀，置于暗处反应30 min，5000 r/min离心10 min后，取上清液于517 nm下测其吸光度值Asample；
测0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL与甲醇2 mL混合后的吸光度值Acontrol；
测甲醇2 mL与供试品溶液2 mL混合后的吸光度值Ablank，并用BHT和维生素C作为对照。利用GraphPad Prism 5软件计算其IC50值，结果见表2。

DPPH自由基清除率(%)=

(1)

由表2可知，五个化合物均表现出较强的抗氧化活性，其中乌奴龙胆苷A的IC50值最低，抗氧化能力最强，而大花龙胆苷B的抗氧化能力最弱。各化合物抗氧化能力大小排序为：维生素C>乌奴龙胆苷E>异红草素>乌奴龙胆苷A>异金雀花素>大花龙胆苷B>BHT。

表2 化合物的抗氧化能力

3.1 在线抗氧化活性成分的筛选条件优化 本研究所用HPLC-DPPH-MS/MS在线抗氧化活性成分筛选是在前期实验室建立的在线抗氧化筛选体系基础上进行了适当修改[20]。不同药材其活性成分种类、含量以及抗氧化活性大小均具有较大差异。同时不同的色谱分离体系对该筛选方法的灵敏度、基线噪音等都有一定的影响。因此，本实验对DPPH的浓度、体积流量、反应池的规格等因素进行了优化。研究中通过对比 DPPH 溶液浓度(10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL)和体积流量(0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.4 mL/min、0.5 mL/min)对筛选筛选效果的影响，结果表明随着DPPH 浓度和体积流量的增大，方法灵敏度有逐渐增加趋势，但较高的浓度和体积流量会造成基线波动，影响筛选效果，因此，选择DPPH 溶液浓度25 μg/mL，体积流量为0.4 mL/min 作为最适浓度和体积流量用于后续筛选。反应池规格会影响反应时间的长短，从而影响筛选效果。本实验对反应池内径(0.13 mm、0.18 mm、0.25 mm)和长度(5 m、10 m、15 m、20 m)进行优化分析。研究结果表明，反应管越长、内径越大，产生DPPH 倒峰的响应越高，但同时较长的反应时间会造成色谱分离度下降，方法分辨率降低。综合考虑以上因素，最终确定内径为0.25 mm，长度为10 m 的PEEK 管为该筛选试验实验最适反应池。

3.2 抗氧化活性与构效关系分析 从大花龙胆中分离得到的5化合物包含两个黄酮碳苷类物质(异荭草素、异金雀花素)和3个环烯醚萜苷类物质(乌奴龙胆苷E、大花龙胆苷B和乌奴龙胆苷A)。研究[20,27-28]证实，黄酮类和环烯醚萜类均是优良的天然抗氧化剂。

抗氧化活性强弱与化合物的化学结构有密切的关系[29-30]。影响黄酮、环烯醚萜等多羟基类化合物的抗氧化活性强弱的因素主要有以下几点：酚羟基的取代数目和位置、双键位置、羟基的苷化以及化合物的空间结构等[31-33]。

异荭草素和异金雀花素的抗氧化活性具有明显的差异，而这两个化合物的结构仅在3′位置存在差异，其中异荭草素为-OH，异金雀花素为-OCH3基团，即-OH基团甲基化后抗氧化活性降低。在槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷)和异鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖苷抗氧化活性比较中也呈现出相同的趋势[34]。因此，笔者推测3′-OH与相邻的4′-OH形成邻二羟基结构，该结构可能是决定抗氧化活性高低的一个重要因素。

乌奴龙胆苷E、大花龙胆苷B和乌奴龙胆苷A的抗氧化活性也呈现出一定的差异。乌奴龙胆苷E为马钱素型的环烯醚萜苷，大花龙胆苷B为裂番木鳖酸型环烯醚萜苷，乌奴龙胆A是二聚环烯醚萜苷，三者结构具有较大差异尤其是大花龙胆苷B的空间构象与乌奴龙胆苷E和乌奴龙胆苷A呈现较大差异，这些结构及空间构象的差异可能导致其抗氧化活性也呈现显著差异[32]。