CRISPR/Cas9技术介导烟草CENH3基因突变体的获得

韩平安 ，孙瑞芬 ，常 悦 ，唐宽刚 ，王 良 ，聂利珍 ，张自强 ，梁亚晖 ，吴新荣 ，李晓东

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；
2.内蒙古自治区甜菜品种遗传改良与种质创制重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010031）

CENH3是组蛋白H3的一个变体，其特异性定位于着丝粒上[1]，可募集其他着丝粒蛋白并与之形成复合体，在有丝分裂和减数分裂时参与着丝粒的组装并和纺锤丝连接，对染色体的正常分离与传递有决定作用[2-4]。编码着丝粒特异性组蛋白基因CENH3是近年来利用诱导系诱导单倍体的一个研究热点[5]。RAVI等[6]通过对拟南芥染色体着丝粒的突变体研究，开发出了通过着丝粒介导使父本或母本染色体选择性丢失，从而获得单倍体的方法。拟南芥CENH3突变体具有致死性，利用组蛋白H3的N末端尾部替换CENH3的N末端尾部，同时将绿色荧光蛋白（GFP）添加到N端终点，形成的GFPtailswap蛋白，定位于着丝粒上，该结构克服了CENH3突变体的致死表型。利用转基因技术获得GFPtailswap Cenh3-/-基因型植株，该植株雄性不育但是能够产生少量花粉，作为父本与野生型进行杂交能够产生5%的母本单倍体，作为母本与野生型进行杂交能够产生25%～50%的父本单倍体[7]。CENH3在不同物种都具有高度进化保守性，对CENH3基因进行修饰获得单倍体诱导系同样适用于其他作物[8-11]。CRISPR/Cas9技术是一种有效的基因组编辑工具[12-16]，可以直接改良农艺性状控制基因，具有精准高效、构建简单、操作简便、成本低廉等特点，现已成功应用于模式植物拟南芥、烟草以及水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等作物[17-21]。CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展和应用为不同作物沉默着丝粒特异性组蛋白CENH3创造单倍体诱导系提供了可能。对玉米CENH3进行遗传修饰，成功获得单倍体，证明了CENH3-tailswap互补系统可以在玉米上作为单倍体诱导系[22-23]。通过筛选被基因组编辑的TaCENH3α-异等位基因组合，获得了可用于小麦商业化的父系单倍体诱导系，诱导率达7%[24]。对拟南芥CENH3进行点突变可以获得单倍体诱导系[7]。本研究以烟草CENH3基因为编辑目标，构建CRISPR/Cas9编辑载体，并通过农杆菌介导法进行烟草遗传转化获得CENH3突变株系，从而为采用CRISPR/Cas9-CENH3技术体系创建甜菜等作物的单倍体诱导系奠定了基础。

1.1 试验材料

本氏烟草（Nicotiana benthamiana）无菌苗、载体pBWA（V）K和 pBWA（V）-Cas9、EHA105农杆菌菌株由内蒙古自治区农牧业科学院甜菜分子育种课题组保存。试验所用试剂（盒）为TaKaRa产品。6 000 bp DNA marker、T4连接酶、限制性内切酶Eco31Ⅰ、LguⅠ、EcoRⅤ等均购自武汉伯远生物科技有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司；
农杆菌感受态细胞EHA105购自北京华越洋生物有限公司，其他常规试剂主要购自TaKaRa公司。引物由南京金斯瑞公司合成，其序列见表1。

1.2 CENH3基因靶位点序列的设计及载体构建

1.2.1 CENH3基因靶标序列

根据烟草 CENH3基因（LOC107795199）cDNA保守序列设计2个靶标以提高编辑效率，靶标1序列：agagcactgagctgttgatcagg，靶标 2序列：gcttgttcgtgaaattgcacagg。扩增含2个靶标序列的sgRNA引物（1F/1R和2F/2R，并引入Eco31Ⅰ酶切位点），序列见表1。

表1 引物信息

1.2.2 sgRNA1和sgRNA2获得

靶标序列较短，故通过引物变性退火就可以得到目的序列。sgRNA1 反应体系（50 μL）：ddH2O 40 μL，引物 1F 5 μL，引物 1R 5 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，55℃10 min，14℃5 min，同样方法获得sgRNA2片段。

1.2.3 CENH3靶标中间载体构建

1.2.3.1 pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1 构建

用Eco31Ⅰ分别酶切目的片段sgRNA1和空载体pBWA（V）-Cas9（细菌抗性为卡纳霉素，植物抗性为潮霉素）并用T4连接酶连接酶切片段。酶切连接反应体系（10.0 μL）：10×buffer 1.0 μL，空载体 1.5 μL，sgRNA1 片段 2.0 μL，Eco31 Ⅰ 0.5 μL，T4-ligase 0.5 μL，ddH2O 4.5 μL。混匀后，37 ℃反应2 h。取5 μL连接物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养16 h后获得白色单菌落，抽提质粒，测序检测目的片段，重组载体命名为pBWA（V）-CAS9/CENH3-B1。

1.2.3.2 pBWD/CENH3-B2构建

用Eco31Ⅰ分别酶切目的片段sgRNA2和空载体pBWD（LB）DNAi（AT），并用T4连接酶连接酶切片段。酶切连接反应体系（10.0 μL）：10×buffer 1.0 μL，空载体 1.5 μL，sgRNA2 片段 2.0 μL，Eco31 Ⅰ0.5 μL，T4-ligase 0.5 μL，ddH2O 4.5 μL。反应条件和转化大肠杆菌同1.2.3.1，测序合格后，重组载体命名为pBWD-CENH3-B2。

1.2.4 双靶标载体CRISPR-Cas9/CENH3构建

用LguⅠ酶切2个中间载体pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1和pBWD/CENH3-B2，并用T4连接酶进行连接。酶切连接反应体系（10.0 μL）：10×T4 buffer 1.0 μL，pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1 1.0 μL，pBWD/CENH3-B2 1.5 μL，Lgu I 0.5 μL，T4-ligase 0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。均匀后，37℃反应 2 h。将 pBWD/CENH3-B2的酶切目的片段插入pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1，获得含有双靶标的重组载体命名为CRISPR-Cas9/CENH3。将双靶标重组载体CRISPRCas9/CENH3转化到农杆菌EHA105中，用引物3F和3R进行菌落PCR扩增载体上的M13片段以检测重组质粒。提取1个PCR检测阳性质粒，用EcoRⅤ酶切进一步进行酶切鉴定。

1.3 烟草的遗传转化及转基因植株PCR检测

用含有编辑载体CRISPR-Cas9/CENH3的农杆菌EHA105转化烟草无菌苗叶片并诱导丛生芽产生，经Zmpl筛选获得抗性植株。提取抗性植株幼叶DNA，并以此为模板，用引物4F和4R扩增Cas9基因片段以检测阳性植株。PCR反应体系：2×PCR Mix 6.25 μL，4F/4R 引物各 0.50 μL，模板 DNA（50 ng/μL）1.00 μL，ddH2O 4.25 μL；
反应程序：94 ℃3 min；
94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环；
72℃ 10 min，4℃保存。

1.4 目的基因拷贝数检测

利用数字PCR（ddPCR）技术，检测转基因植株中CENH3基因的拷贝数。首先对CENH3基因的扩增引物5F/5R（表1）和内参基因RNR2（拷贝数为1）的扩增引物6F/6R（表1）的特异性进行检测。之后用特异引物5F和5R对PCR检测阳性植株进行CENH3基因插入拷贝数检测。ddPCR扩增体系（25.0 μL）：2×PerfeCTa Qpcr ToughMix UNG 5.0 μL，AlexaFluorTM6471.0 μL，EvaGreen20×inwater2.0 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 2.0 μL，ddH2O 14.2 μL。数字 PCR扩增程序为94℃ 5 min；
95℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环；
72 ℃ 5 min。每个样品进行3个平行重复试验。外源基因拷贝数=外源基因浓度/内参基因浓度。

2.1 CENH3基因编辑载体构建

提取2个中间载体pBWA（V）-Cas9/CENH3-B1和pBWD/CENH3-B2质粒DNA，通过测序证实目的片段已正确插入。2个中间载体通过LguⅠ酶切并用T4连接酶后，获得的双靶标编辑载体CRISPRCas9/CENH3经PCR检测M13片段，获得条带大小为857 bp（图1a），符合预期。提取1个PCR检测阳性质粒进一步进行EcoRⅤ酶切鉴定，获得5条大小正确的条带，分别为 7 023、3 570、2 625、2 200、279 bp（图1b），表明双靶标编辑载体CRISPR-Cas9/CENH3构建成功。

图1 CRISPR-Cas9/CENH3的PCR检测（a）和酶切鉴定（b）

2.2 转基因植株获得及PCR检测

用含有编辑载体CRISPR-Cas9/CENH3的农杆菌转化烟草获得Zmpl抗性植株，随机提取11株抗性植株叶片基因组DNA进行Cas9基因的PCR检测，扩增片段大小均为577 bp，符合预期（图2），初步判断目的基因已整合到烟草基因组染色体上。

图2 转基因植株PCR检测

2.3 CENH3突变体检测

为了验证靶标序列是否发生突变，对转基因烟草T0代植株和野生型CENH3基因靶序列进行扩增并测序分析。测序结果表明，11株转基因植株中有6株为编辑植株（表2），编辑效率为54.5%。进一步分析表明，靶标1未发生突变，靶标2序列上发生4种突变类型，分别为单碱基插入纯合突变（两条染色体均插入1个碱基“T”，如1号和5号株系），一条染色体单碱基插入杂合突变（插入1个碱基“A”，如2号株系），单碱基插入杂合突变（其中一条染色体插入1个碱基“T”，另一条染色体插入1个碱基“C”，如4号株系），单碱基插入和多碱基缺失的杂合突变（其中一条染色体插入1个碱基“T”，另一条染色体缺失6个碱基“CAATTT”，如3号和6号株系）。

表2 转基因株系突变类型

2.4 目的基因拷贝数检测

利用ddPCR技术对6株突变体进行插入拷贝数检测。首先以烟草RNR2为内参基因，对目的基因CENH3的扩增引物（5F/5R）的特异性进行检测。由图3可知，2个基因对应引物的阳性微滴（蓝色带）与阴性微滴（黑色带）都能明显区分，表明CENH3引物的特异性较好。其次，对ddPCR的重复性进行分析，所有样品CENH3和RNR2基因的试验有效微滴总数平均为24 050～27 924（表3），满足微滴数字PCR微滴的分析要求，试验中生成微滴的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.8%～3.6%（表3），小于25%，符合欧盟核酸定量检测的要求，说明试验中建立的微滴数字PCR体系微滴生成稳定，重复性良好，数据可靠性高。对6株突变体进行拷贝数分析，结果表明，所有突变体均为低拷贝转基因植株，CENH3基因的插入拷贝数均在 0.3～1.2（表 4）。

图3 ddPCR引物特异性检测

表3 引物ddPCR重复性检测

表4 转基因株系CENH3基因拷贝数检测

基因编辑是探究基因功能的重要技术之一，通过对目的基因的定点敲除、添加或修饰探究特定基因的功能[25]。CRISPR/Cas9技术是目前主流基因编辑技术，因其具有载体构建简单易行、特异性好、打靶效率高等特点，该系统已被广泛应用于作物改良育种[26]。

获得单倍体的方法有很多，如体外诱导（雄配子体诱导和雌配子体诱导）、种间或种内的选择性杂交、对着丝粒特异性组蛋白编码基因CENH3进行基因组编辑（CRISPR/Cas9）等均用于诱导单倍体的产生[27]。单倍体育种利用染色体加倍产生完全纯合的双单倍体，相比传统育种是一种高效快速的植物育种方法[28-29]。利用CRISPR/Cas9系统直接修饰CENH3 在拟南芥[6]、玉米[30-31]和小麦[24]、甘蓝[32]等植物上均获得了单倍体植株。研究表明，拟南芥CENH3无效突变体具有致死性，将经过遗传修饰的CENH3导入该拟南芥突变体，可恢复植株的野生表型，转基因植株与野生型植株杂交可产生只含野生型基因组的单倍体[6]。

本研究以烟草CENH3为编辑目标，利用CRISPR/Cas9技术对CENH3进行定点编辑获得了编辑植株，编辑效率为54.5%。从编辑效率来看，本研究设计的靶标及构建的编辑载体是合理有效的，实现了对烟草CENH3的定点编辑，为利用CRISPR/Cas9编辑系统进行甜菜CENH3基因编辑，为获得甜菜单倍体诱导系奠定了基础。