葡萄白粉病菌环介导等温扩增检测体系的建立与应用*

王雯雯，刘心缘，马云妮，顾沛雯

（宁夏大学农学院，银川 750021）

葡萄白粉病是由葡萄钩丝壳菌（Uncinula necator）引起的一种真菌性病害，主要侵染葡萄的叶片、新梢、果实等部位[1]。幼叶受害后，病斑初期呈半透明状，逐步发展后叶片正面覆盖有灰白色的粉状物，严重时白粉可布满叶片正反两面，并迅速蔓延至嫩茎、果粒和果梗，造成大量裂果，叶片黄化脱落，减产严重[2]。葡萄白粉病的发生和流行需要高温闷热的天气条件，当气温为20～27 ℃、空气相对湿度为40%～85%时最适宜分生孢子的萌发和传播，病害一旦发生，会迅速侵染周围健康叶片，田间蔓延速度极快[3]。葡萄白粉病菌是一种活体营养专性寄生菌，无法人工培养，这在一定程度上影响了对该菌的早期诊断、监测和遗传多样性等方面的深入研究。目前对于葡萄白粉病菌的早期诊断和检测，主要采用传统的单孢子分离和保湿培养的方法[4]，但是该方法费时费力且缺乏准确性，难以满足对越冬和潜伏期菌源的监测需要。因此，在生产中急需一种实用、操作简便且快速准确的葡萄白粉病菌检测方法。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi 等于2000 年研发的一种新型核酸扩增方法[5]。该方法针对目的基因序列的特异性区域设计不同的内外引物，在具有链置换活性的DNA 聚合酶催化作用下，能够形成大小不一的茎环结构和多环花椰菜结构的DNA 片段混合物。该方法具有反应时间短、特异性强、灵敏度高、易于操作的特点，被广泛应用于植物病原真菌、细菌和病毒等病原的检测[6-7]。Kong等[8]实现了葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的LAMP 快速检测，为确定葡萄霜霉病防控适期提供指导。黄雯等[9]建立的茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）LAMP检测方法，实现了田间快速检测。赵媛媛等[10]建立了玉米茎腐病的强雄腐霉（Pythium arrhenomanes）LAMP 体系，在60 min 内即可快速、准确地获得检测结果，能够满足现场快速检测的要求。

本研究根据GenBank 中葡萄白粉病菌（U.necator）的细胞色素P450 全长基因序列设计3 组LAMP 引物，通过优化反应条件及体系，检测方法的特异性、灵敏性以及实用性，构建葡萄白粉病菌LAMP 检测技术体系，旨在为葡萄白粉病菌的早期诊断和预测预报提供一种切实可行的方法。

1.1 试验材料

11 种葡萄及其他作物病原菌（表1）经过单孢子分离，接种于健康寄主植物繁育后，通过形态学观察和rDNA-ITS 序列分析进行菌株鉴定，-80 ℃保存于宁夏大学农学院植物病理实验室。

表1 供试菌株

1.2 仪器与试剂

所用仪器：Simpli Nano 超微量分光光度计（GE Healthcare 公司，美国），T 100TM Thermal Cycler PCR仪（Bio Rad 公司，美国），Azure c200 凝胶成像系统（Azure Biosystems 公司，美国），Blook 蓝光透照仪（Genedirex 台湾德怡科技有限公司），Sigma 3K 15 通用台式冷冻离心机（Sigma 公司，美国）。

所用试剂：真菌DNA 提取试剂盒（Biospin®Fungus Genomic DNA Extraction Kit，BioFlux 公司，日本），植物DNA 提取试剂盒（E.Z.N.A.®HP Plant DNA Mini Kit，Omega Bio-tek 公司，美国），Bst DNA polymerase（New England Biolabs 公司，美国），甜菜碱（Sigma Aldrich 公司，美国），dNTP Mixture（BBI 生命科学有限公司），Taq PCR Master Mix［生工生物工程（上海）股份有限公司］，SYBR Green I（上海瑞楚生物科技有限公司），2 000 bp DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank 中葡萄白粉病菌细胞色素P450基因序列（登录号：EF649777.1），运用Primer explorer V4（http://primerexplorer.jp/）在线设计LAMP引物，参照LAMP 引物设计原则，通过引物自由能、引物长度以及GC 含量等筛选获得3 组LAMP 引物（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 LAMP 引物序列

1.4 LAMP 引物筛选及特异性检测

使用Biospin®Fungus Genomic DNA Extraction Kit 提取菌丝DNA。用E.Z.N.A.®HP Plant DNA MiniKit 提取葡萄叶片总DNA。用Simpli Nano 超微量分光光度计检测DNA 浓度及OD值，-20 ℃保存备用。

依据Kong等[8]的方法建立LAMP 反应体系，并且进行调整：DNA 模板1 μL，10×Thermopol Buffer 2.5 μL，50 μmol/L FIP/BIP 0.7 μL，20 μmol/L F3/B3 0.25 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，5 mol/L 甜菜碱5 μL，10 mmol/L MgCl26 μL，8 U/μL bst DNA polymerase 1 μL，ddH2O 补足至25 μL。反应条件为：65 ℃恒温扩增75 min。利用上述反应体系以葡萄白粉病菌DNA 为模板，对合成的3 对引物进行LAMP 扩增筛选。反应结果通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，或加入SYBR Green I 荧光染液，在自然光下和蓝光仪下观察颜色变化（阳性为绿色且有荧光，阴性为橙色且无荧光）。

使用筛选出的引物对上述（表1）提取的11 种病原真菌DNA 进行LAMP 扩增，以ddH2O 为空白对照，检测引物的特异性。

1.5 LAMP 反应体系的优化

依据1.4 的LAMP 检测方法，对反应条件进行优化。分别检测反应时间（30～120 min）、反应温度（50～70 ℃）、Bst DNA 聚合酶浓度（0.192～0.512 U/μL）、甜菜碱浓度（0～1.6 mol/L）、dNTPs 浓度（0～3.0 mmol/L）、Mg2+浓度（0～8.0 mmol/L）和内外引物配比（1∶1～10∶1）对LAMP 的影响。

1.6 LAMP 反应体系灵敏度检测

将葡萄白粉病菌的DNA 基因组经超微量分光光度计测定浓度后按10 倍稀释，对应的浓度分别为100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL 和10 fg/μL，分别以各稀释梯度的DNA 溶液为模板，以ddH2O 为空白对照，进行LAMP 和常规PCR 检测，比较二者的检测灵敏度差异。

常规PCR 以葡萄白粉病菌细胞色素P450 全长基因序列为检测靶标，引物序列为Uc592+5′-AGTT AAAAGATGTCAACGCCGAAGA-3′、Uc946-5′-AGC GGCAAAAGATGAGTCAAAATTC-3′[11]。PCR 反应体系（25 μL）：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 补足体系至25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 田间葡萄白粉病样品检测

2021 年8 月1 日在宁夏立兰酒庄、蒲尚酒庄、新牛酒庄和玉泉营苗木繁育基地4 个葡萄园采集共40 份葡萄白粉病病叶，在宁夏大学食品与葡萄酒学院采集10 份葡萄无菌组培苗叶片，以ddH2O 为空白对照，无菌组培苗叶片为阴性对照，按照1.4 的方法提取葡萄叶片总DNA，使用优化后的LAMP 反应体系进行扩增。

2.1 引物筛选

如图1 所示，只有引物UN-LAMP-1 能够扩增出明显的梯状条带，其他引物均无条带出现。加入SYBR Green I 荧光染液后，引物UN-LAMP-1 反应液为绿色，在蓝光仪下呈现出荧光；
其他反应液为橙色，在蓝光仪下无荧光出现（图版2-A、B）。

图1 引物筛选

2.2 特异性检测

如图2 所示，只有葡萄白粉病菌DNA 扩增出梯状条带，其他菌种DNA 和对照均未出现条带。加入SYBR Green I 荧光染液后，葡萄白粉病菌DNA 反应液为绿色，在蓝光仪下呈现出荧光；
其他菌种DNA以及对照的反应液均为橙色，在蓝光仪下无荧光出现（图版2-C、D）。说明该引物特异性较好。

图2 引物特异性检测

2.3 LAMP 反应体系的优化

2.3.1 反应时间

如图3 所示，当反应时间为45 min 时开始出现条带但亮度较浅，当反应时间为60、75 min 时条带最亮且最清晰，当反应时间为90、105、120 min 时条带虽然较亮但清晰度较差。加入SYBR Green I 荧光染液后，当反应时间为60、75 min 时反应液为绿色且荧光较强，反应时间为90、105、120 min 时次之，反应时间为45 min时反应液为绿色但荧光较暗，反应时间为30 min 时反应液为橙色且无荧光（图版2-E、F）。为节约时间，选择60 min 作为后续试验的反应时间。

图3 反应时间对LAMP 的影响

2.3.2 反应温度

如图4 所示，当反应温度为50～70 ℃时均可扩增出梯状条带，随着温度的升高梯状条带亮度先升高后下降，在65.9 ℃时条带最亮。加入SYBR Green I 荧光染液后，在蓝光仪下均可见荧光，当反应温度为50.0～62.0 ℃时，反应液为绿色且荧光随温度的增加而增强；
当反应温度在65.9～70.0 ℃时，反应液为绿色且荧光随温度的增加而变暗（图版2-G、H）。因此，选择62.0 ℃为LAMP 的最佳反应温度。

图4 反应温度对LAMP 的影响

2.3.3 DNA 聚合酶浓度

如图5 所示，Bst DNA 聚合酶在终浓度变化为0.256～0.512 U/μL 浓度梯度下均出现条带，在浓度为0.256 U/μL 时出现梯状条带但较浅，当浓度为0.320 U/μL时梯状条带最清晰，在0.384～0.512 U/μL时随着浓度的增加条带亮度减弱。加入SYBR Green I 荧光染液后，当Bst DNA 聚合酶浓度在0.320～0.512 U/μL时，反应液为绿色且荧光较强；
在0.192～0.320 U/μL时，反应液由橙色逐渐转为绿色且荧光随着Bst DNA 聚合酶浓度的增加而增强（图版2-I、J）。因此，反应体系中Bst DNA 聚合酶的最佳浓度为0.320 U/μL。

图5 Bst DNA 聚合酶浓度对LAMP 的影响

2.3.4 甜菜碱浓度

如图6 所示，当甜菜碱在终浓度为0～1.6 mol/L浓度梯度下均有梯状条带出现，但当终浓度为0 时条带极浅，当终浓度为0.8 mol/L 时梯状条带最明亮且清晰。加入SYBR Green I 荧光染液后，当终浓度在0～0.4 mol/L时，反应液由橙色逐渐转变为绿色且荧光逐渐增强；
在0.4～1.6 mol/L时，反应液均为绿色且荧光较强、差异较小（图版2-K、L），因此，选取终浓度为0.8 mol/L 的甜菜碱为反应体系的最佳含量。

图6 甜菜碱浓度对LAMP 的影响

2.3.5 dNTPs 浓度

如图7 所示，当dNTPs 的终浓度为0 时无梯状条带出现，随着dNTPs 浓度的升高，梯状条带亮度与清晰度均逐渐增加，在2.6 mmol/L 时达到最亮、最清晰。加入SYBR Green I 荧光染液后，随着dNTPs浓度的升高，反应液由橙色逐渐转变为绿色且荧光逐渐增强；
在1.6～3.0 mmol/L时，反应液均为绿色且荧光较强、差异较小（图版2-M、N）。因此，选取终浓度为2.6 mmol/L 的dNTPs 为反应体系的最佳含量。

图7 dNTPs 浓度对LAMP 的影响

2.3.6 Mg2+浓度

如图8 所示，当Mg2+终浓度在0～8.0 mmol/L时均有梯状条带出现，当终浓度为4.8 mmol/L时，条带最亮且最清晰。加入SYBR Green I 荧光染液后，当Mg2+终浓度在0～1.6 mmol/L时，反应液由橙色逐渐转变为绿色且荧光随着终浓度的增加而逐渐增强；
当Mg2+终浓度在2.4～8.0 mmol/L时，反应液均为绿色且荧光较强、差异较小（图版2-O、P）。因此，选取终浓度为4.8 mmol/L 的Mg2+为反应体系的最佳含量。

图8 Mg2+浓度对LAMP 的影响

2.3.7 内外引物配比

如图9 所示，当内外引物比例在2∶1～10∶1时均有梯状条带出现，在比例为6∶1 时条带最亮且最清晰。加入SYBR Green I 荧光染液后，当比例在1∶1～3∶1时，反应液为橙色且荧光亮度均较暗；
当比例在3∶1～10∶1时，反应液均为绿色且荧光较强、差异较小（图版2-Q、R）。因此，选择6∶1 为LAMP 的最佳内外引物配比。

图9 内外引物配比对LAMP 的影响

2.4 灵敏度检测

利用优化后的LAMP 体系和常规PCR 对10 倍浓度梯度稀释的基因组DNA 进行扩增，如图10 所示，常规PCR 方法的检测灵敏度为10 pg/μL；
而优化后的LAMP 体系的检测灵敏度为1 pg/μL（图11，图版2-S、T），灵敏度是常规PCR 的10 倍。

图10 常规PCR 灵敏度检测

图11 LAMP 灵敏度检测

2.5 田间葡萄白粉病的LAMP 检测

从宁夏立兰酒庄、蒲尚酒庄、新牛酒庄和玉泉营苗木繁育基地采集共40 份葡萄白粉病的病叶，在宁夏大学食品与葡萄酒学院采集10 份葡萄无菌组培苗叶片，提取叶片总DNA，应用建立的LAMP 体系进行扩增，结果如表3、图12 和图版2-V、W 所示，优化后的LAMP 体系能够检测出不同来源的葡萄白粉病病叶，准确率达100%。

表3 田间样品检测结果

图12 LAMP 检测田间葡萄白粉病（部分样品）

预测预报技术是准确防控葡萄白粉病、减少农药使用和精准施用的关键。因此，开展葡萄白粉病预测预报研究，对于科学防治葡萄白粉病具有重要的意义[12]。分子检测技术是作为预测预报的重要手段，可为精准的预测预报提供分子技术方案[13]。目前已成功建立了普通PCR 和荧光定量PCR 检测葡萄白粉病的方法。Bouscaut等[14]利用葡萄白粉病菌CYP51基因设计了一对特异性引物TransA/RtransA，建立了葡萄白粉病菌常规PCR 检测体系，并对田间采集的575 份不同地区的葡萄白粉病样品进行检测。顾沛雯等[15]利用葡萄白粉病菌ITS 基因序列设计了1 对特异性引物UNF2/UNR2，建立了实时荧光定量PCR 反应体系，并对人工接种葡萄白粉病菌的潜伏期叶片内病原菌DNA 进行real-time PCR 检测。但常规PCR 和荧光定量PCR 都依赖于精密的仪器设备和昂贵的试剂，不仅检测成本高，而且对检测人员专业能力要求也较高，难以广泛应用于田间植物病原物的现场检测[16]。而LAMP 检测方法具有操作简单、灵敏性强、准确率高等优点，并且可在60 min 左右得到结果，大幅度缩短了检测时间[7]。

目前，LAMP 检测方法多数是以真菌通用ITS序列作为靶标，如Fukuta等[17]依据群结腐霉（Pythium myriotylum）的ITS 序列设计LAMP 特异性引物，能够从水培样品中检测到P.myriotylum，显示出与常规PCR 一致的敏感度；
杜然等[18]以ITS 序列作为检测靶标，建立了特异性的油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌的LAMP 检测方法，为高通量检测油菜黑胫病菌和茎基溃疡病菌奠定了基础。但笔者前期根据葡萄白粉病菌ITS 序列设计的1 对内引物和1 对外引物建立的葡萄白粉病菌LAMP 检测体系，不仅能够检测到葡萄白粉病菌DNA 基因组，同样也能够检测到瓜类等其他植物白粉病菌DNA 基因组，特异性较差。ITS 序列在不同物种间较保守，尤其在相近物种间序列差异更小，因此特异性不高是其缺陷[19]。本研究使用细胞色素P450 全长基因序列设计筛选出以UNITF3-1/UNITB3-1 为外引物，UNITFIP-1/UNITBIP-1 为内引物，特异性较好，可用于建立葡萄白粉病菌LAMP 检测体系。

本研究获得了葡萄白粉病菌LAMP 最佳反应条件：以UNITF3-1/UNITB3-1 为外引物、UNITFIP-1/UNITBIP-1 为内引物，反应体系中Bst DNA 聚合酶浓度为0.320 U/μL，甜菜碱浓度为0.8 mol/L，dNTPs浓度为2.6 mmol/L，Mg2+浓度为4.8 mmol/L，内外引物配比为6∶1，在62 ℃反应60 min，可最低检测到1 pg/μL 的葡萄白粉病菌。所建立的体系适用于田间葡萄样品的检测，反应稳定且便于操作，若检测时无PCR仪，能够使用其他恒温设备完成反应过程[10]。在对扩增产物进行检测时，除使用琼脂糖凝胶电泳检测的方法外，还可使用核酸染料染色来确定样品是否感染葡萄白粉病菌。本研究所建立的葡萄白粉病菌LAMP 检测体系特异性强，检测时间短，能够满足各基层技术部门对于葡萄白粉病菌的快速检测的需求，具有实用性和推广价值。