复合益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

郝 爽，张振国，尤宏争，马 林，唐红霞，刘肖莲，徐晓丽，谷德贤，罗 璋

(1.天津市水产研究所，天津 300221；

2.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；
3.天津农学院，天津 300384)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是我国重要的水产养殖品种，2018年该品种养殖产量达1.117×106t[1]。目前，病害仍然是限制凡纳滨对虾产业发展的重要因素之一，2018年我国因病害造成的凡纳滨对虾养殖经济损失达117.8亿元[2]。其中，由致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的急性肝胰腺坏死病是一种常见病害，患病虾的主要症状为空肠空胃，肝胰腺发白，病理切片显示肝胰腺小管崩塌、上皮细胞严重脱落[3-5]。传统养殖中常使用化学制品和抗生素控制疾病的发生，由此带来的药物残留和耐药菌株问题，越发受到社会关注。因此，寻找绿色环保的药物替代品已成为研究热点[6-7]。

益生菌是一种活性微生物，具有安全、无毒、无副作用等特性。许多研究表明，益生菌可以通过改善水体养殖环境、调节对虾肠道内微生态平衡和影响宿主黏膜与系统免疫等方式减少病害的发生[8]。目前，常用于对虾养殖中的益生菌种类主要有乳酸菌、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母菌等[9-11]。当前研究较多的为单一菌株对宿主的影响，而复合益生菌在对虾养殖中的使用效果研究相对较少。此外，关于益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响研究，绝大部分集中于投喂期间，而对停止投喂后的变化关注较少，实际应用中，益生菌常被施用于养殖关键期而非全周期，因此投喂益生菌制剂后对机体的持续影响值得探讨。

在前期工作中，本实验室筛选到2株能对副溶血弧菌产生拮抗作用的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，并委托某企业进行小批量试制。笔者选用枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌制成的复合益生菌，将其加入凡纳滨对虾基础饲料中，在连续投喂益生菌28 d和结束投喂28 d后，分别测定凡纳滨对虾肠道微生物菌群的变化，比较不同时期机体肠道菌群结构，并结合人工感染试验，探讨复合益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道菌群组成和抗病力的影响，以期为复合益生菌在对虾养殖中的应用提供参考。

1.1 饲料制备

试验用复合益生菌制剂由本实验室保存，其中枯草芽孢杆菌密度为5×106cfu/g，乳酸乳球菌密度为5×107cfu/g。参照文献[12]的研究结果，向基础饲料中拌入0.5%复合益生菌，制成试验饲料备用。

1.2 饲养管理

试验用健康凡纳滨对虾由天津市晟淼水产养殖有限公司提供，初始体长(6.88±0.53) cm，初始体质量(2.22±0.32) g。试验开始前先进行对虾白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei)、致病性副溶血弧菌、偷死野田村病毒等几种常见病原检测，以确定其不含特定病原。

凡纳滨对虾暂养14 d后随机分为2组，即复合益生菌试验组和对照组，每组设3个平行，每个平行200尾虾，分别置于容量为1000 L的养殖桶中，水温(24.5±0.5) ℃，盐度25，连续充氧保持含量5 mg/L以上。养殖试验周期56 d，试验开始前禁饲24 h，试验期间每日投饲3次，日投饵量为凡纳滨对虾体质量的6%～10%，投喂比例分别为20%、20%和60%。试验组凡纳滨对虾先投喂试验饲料28 d，后投喂基础饲料28 d，对照组持续投喂基础饲料56 d。

1.3 样本采集与处理

在试验第28天和第56天采集样本，从试验组和对照组的3个平行中，每平行随机抽取5尾凡纳滨对虾，用体积分数75%乙醇擦拭凡纳滨对虾体表，无菌条件下于冰盘上剖取凡纳滨对虾完整肠道，将同平行的5尾凡纳滨对虾肠道合并为1个样本，各时间点每组共采集3个平行样本。凡纳滨对虾肠道用生理盐水漂洗后装入无菌冷冻管，迅速置于液氮中，后转移至实验室于-80 ℃保存，以备肠道菌群检测分析。

1.4 肠道微生物基因组测序分析

委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司提取样本肠道微生物基因组DNA，针对细菌16S rDNA基因V3+V4区片段设计通用引物，PCR扩增后进行产物回收纯化。根据所扩增的16S区域特点，构建小片段文库，基于Illumina Nova测序平台对该文库进行双末端测序，经过Reads拼接、过滤后得到有效数据，基于97%一致性将序列聚类成为运算分类单元(OTUs)，然后对运算分类单元序列比对到Silva132数据库进行物种注释分析。

根据运算分类单元分析结果：一方面，对每个运算分类单元的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息及分布情况，对运算分类单元进行丰富度、多样性指数分析，比较样本菌群结构组成；
另一方面，对运算分类单元进行多序列比对，通过主坐标分析(PcoA)和样本聚类树展示，探讨不同组别间群落结构的差异。

1.5 攻毒试验

致病性副溶血弧菌菌株DX-2018-1由本实验室保存，参照文献[13]方法测定其半致死密度(LC50)：将180尾平均体长(8.40±1.30) cm、平均体质量(4.31±1.02) g的健康凡纳滨对虾随机分成6组(4个感染组，1个对照组，1个空白组)，养殖于天津市水产研究所淡水试验站室内圆形养殖桶(有效水体100 L)。感染组设置9.7×106、9.7×105、9.7×104、9.7×103cfu/mL的4种密度梯度菌液进行浸泡感染；
对照组凡纳滨对虾用不含细菌的海水进行模拟感染；
空白组凡纳滨对虾不进行模拟感染，一直正常养殖。预试验期间凡纳滨对虾每日投饲3次、换水1次，换水量为总水体的30%，并相应补充菌液以维持海水中原菌液密度。连续观察7 d，记录凡纳滨对虾的存活情况，计算半致死密度。

养殖试验第28天，从试验组和对照组的3个平行中，每平行随机取30尾虾，用2×半致死密度菌液进行浸泡感染攻毒试验，饲养管理方式与预试验相同，连续观察14 d，记录对虾存活情况，计算累计死亡率。

1.6 数据处理

攻毒试验结果数据用平均值±标准差表示，用SPSS 13.0软件独立样本t检验进行分析，显著性水平为0.05，极显著性水平为0.01。

2.1 物种注释及样本复杂度分析

对测序原始数据进行处理后，在97%相似性水平上生成运算分类单元序列，统计各组样本总序列及运算分类单元数量，进行Alpha多样性指数分析(表1)。各组样本总序列均值为65 469 bp，产生的运算分类单元数量为393～872个。在相同时间点，试验组运算分类单元数量均值均高于对照组，其中第28天试验组样本运算分类单元数量均值最高。

用Observed species和Chao1指数度量样本菌群丰度，Shannon指数评估样本菌群多样性。同一时间点，试验组样本的Observed species、Chao1和Shannon指数均值均高于对照组；
第56天，试验组Observed species和Chao1指数均值较该组第28天有所降低，但仍高于对照组。

表1 不同时间点2组样本的菌群多样性(n=3)

等级聚类曲线可直观反映样本中物种的丰度和均匀度，第28天试验组物种丰度和均匀度最高，第56天对照组物种丰度最低，同一时间点试验组样本物种丰度均高于对照组(图1)。这与菌群多样性指数分析结果一致。

图1 不同时间点2组样本等级聚类曲线Fig.1 The Rank-Abundance curves of samples from two groups at different time

2.2 菌群结构组成的变化

根据各组物种注释及丰度统计结果，选取在门分类水平上丰度排名前10的物种进行分析(图2)。各组凡纳滨对虾肠道菌群在门水平上组成成分主要有变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、疣微菌门、软壁菌门等。第56天，试验组中放线菌门、厚壁菌门菌群比例高于其他各组。试验期间，各组肠道中不同门类菌群比例发生变化，但变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门总含量均在95%以上，占主要优势。

选取丰度排名前20的属，根据其在各组中的丰度信息进行聚类分析，颜色深浅表示物种丰度的高低(图3)。第28天，弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)在对照组中比例较大，而在试验组中比例较小；
第56天，对照组中黏着杆菌属(Tenacibaculum)比例较大；
同一时间点，鲁杰氏菌属(Ruegeria)在试验组中比例均大于对照组。

2.3 多样本比较分析

对各组样本作主坐标分析(图4)：每个点表示1个样本，同一平行的3个样本用相同符号表示；
样本在图中距离越接近，微生物群落结构越相似，差异性越小。对照组两个时间点的样本距离较近，微生物群落组成相似度较高；
在主成分1上，对照组与第28天试验组距离相比于第56天试验组更远。

为研究不同样本间的相似性，基于各样本运算分类单元分析结果，以Unweighted Unifrac距离算法，对样本距离矩阵进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析，构建样本聚类树，2组间的分支长度越短，表示在物种多样性方面存在的差异越小(图5)。对照组的2个时间点样本聚为一支，再与第56天试验组聚为一支，第28天试验组单独聚为一支，这与主坐标分析结果一致。

图2 不同时间点2组样本在门水平上的物种丰度Fig.2 Species abundance of samples from two groups at different time on phylum level

图3 不同时间点2组样本在属水平上的物种丰度聚类分析Fig.3 Cluster analysis of species abundance of samples from two groups at different time on genus level

2.4 攻毒试验凡纳滨对虾累计死亡率

不同密度副溶血弧菌DX-2018-1引起凡纳滨对虾的死亡数见表2，根据凡纳滨对虾死亡数量，计算该菌株对凡纳滨对虾的半致死密度为7.7×105cfu/mL。

用1.54×106cfu/mL(2×半致死密度)密度DX-2018-1菌液对凡纳滨对虾进行攻毒试验，试验组凡纳滨对虾累计死亡率(64.4±11.7)%，对照组累计死亡率(81.1±5.1)%，试验组凡纳滨对虾累计死亡率平均降低16.7%，但与对照组差异不显著(P>0.05)(图6)。

图4 基于运算分类单元水平的主坐标分析Fig.4 PCoA analysis based on OTU level

图5 基于Unweighted Unifrac算法的非加权组平均法聚类树Fig.5 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac algorithm

图6 攻毒试验结果Fig.6 Results of an artificial infection test

3.1 添加复合益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构影响

肠道微生物与机体营养代谢、胃肠道发育及免疫防御有着密切联系，对于虾类的生长存活具有重要生理意义[14]。研究表明，益生菌可以通过与有害微生物竞争营养物质及生存繁殖空间，拮抗有害微生物生长，从而改善水产动物的肠道菌群组成[15]。近几年兴起的高通量测序技术，使微生物区系组成研究更加精确，能够深入揭示菌群结构多样性和复杂性，已成为研究肠道微生物群落的主要技术之一[16-17]。本试验结果表明，连续投喂复合益生菌28 d能提高凡纳滨对虾肠道菌群的丰度和多样性；
且在停止投喂28 d后仍对凡纳滨对虾肠道微生物产生持续影响，这可能与益生菌在肠道中的定殖有关。目前，水产动物养殖业使用的益生菌大多为非土著来源菌株，特别是陆源性的芽孢杆菌和光合细菌等菌株应用较多，这些非土著益生菌在水产动物肠道中难以稳定存在和持续发挥作用[12,18]。本试验选用的枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌是本实验室自健康凡纳滨对虾肠道中筛选获得，这种土著菌株能更好地在虾肠道中定殖，投喂后发挥作用的时间更长。

许多学者通过对不同养殖模式、养殖阶段和生长环境的虾类研究发现，变形菌门、放线菌门、厚壁菌门等为健康对虾肠道菌群主要门类[19-20]，这与本试验结果相似。试验期间，不同门类菌群在各组肠道中比例发生变化，但主要门类细菌仍占优势，表明投喂复合益生菌不会破坏凡纳滨对虾肠道主体菌门类的优势地位。

在属水平上，不同时间点各组凡纳滨对虾肠道优势菌有明显差异。第28天，弧菌属、假交替单胞菌属在对照组中比例较大，而在试验组中比例较小，说明添加复合益生菌在一定程度上抑制了这两种细菌的繁殖。已有研究表明，弧菌属和假交替单胞菌属是对虾肠道中常见菌群，但其中有些种类是条件致病菌，当外界环境恶劣，对虾抵抗力下降时，条件性致病菌大量繁殖，导致疾病暴发的可能性往往要大于专性病原菌[21-23]。许多研究表明，乳酸菌和芽孢杆菌能抑制多种弧菌及其他细菌的生长[24-26]；
胡毅等[27]发现，饲料中添加单一或复合益生菌能显著降低凡纳滨对虾肠道弧菌数。这与本试验结果类似。第56天，对照组中黏着杆菌属比例较大，而试验组中该菌比例较小。在分类地位上，黏着杆菌属归属于黄杆菌科，黄杆菌科中多数成员为条件致病菌[28]，在病害趋向水体浮游细菌群落中占据较高的相对丰度[29]；
已有研究证实，黏着杆菌属细菌易引起水产动物发病，其丰度增大可能提高机体的发病率[30]。同一时间点，鲁杰氏菌属在试验组中比例均大于对照组。Sonnenschein等[31]发现1种鲁杰氏菌(Ruegeriamobilis)基因组中存在大量原噬菌体和毒素抗毒基因，认为其具有作为水产益生菌开发的潜力。本试验中，组间菌群结构存在变化差异，说明复合益生菌能在投喂期间和停喂后促进对虾肠道有益菌的生长，抑制条件致病菌增殖，具有调节虾类肠道微生态平衡，改善肠道微环境的作用。

主坐标分析和非加权组平均法聚类分析结果显示，对照组第28天和第56天微生物群落组成相似度较高，与试验组第56天有一定差别，且与试验组第28天差别较大，说明饲料中添加复合益生菌能影响凡纳滨对虾肠道微生物组成，在停止投喂后仍会对肠道菌群的结构产生影响。

3.2 添加复合益生菌对凡纳滨对虾抗病力影响

许多研究表明，饲料中添加益生菌能增强对虾抗病原感染能力、提高对虾抗病力，如添加芽孢杆菌[32]、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)[33]或复合益生菌[34]，均能提高凡纳滨对虾感染弧菌后的成活率。

本试验结果表明，饲料中添加复合益生菌能在一定程度上提高对虾抗副溶血弧菌的感染能力，这可能与选用的枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌能拮抗副溶血弧菌有关，虽然其拮抗机理还不明确，但前期研究表明，这2个菌株均能分泌抑制副溶血弧菌生长的活性物质。肠道菌群分析也表明，试验组凡纳滨对虾肠道中弧菌属细菌的数量少于对照组。

此外，对虾抗副溶血弧菌感染能力的提升还可能与对虾免疫力的增强相关[35-36]。王国霞等[37]在凡纳滨对虾幼虾饲料中添加不同水平乳酸菌制剂，均能不同程度影响体液免疫因子，提高对虾免疫力。由于受试验条件限制，笔者未能开展相关研究，将在今后工作中进一步验证。

在本试验条件下，连续投喂复合益生菌28 d能提升凡纳滨对虾肠道菌群的丰度和多样性，提高副溶血弧菌感染后的成活率，且在停止投喂28 d后仍对肠道菌群结构产生持续影响，证明了该复合益生菌对凡纳滨对虾具有益生作用，并为优化投喂策略、降低养殖成本提供了理论依据。