氟啶胺在三七中的降解行为及安全性评价

李文希，代雪芳，张雪燕，浦恩堂

(云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205)

【研究意义】三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. h. Chen]为五加科人参属多年生宿根草本植物，是驰名中外的名贵中药材，也是预防和治疗心血管疾病的首选药材[1-2]。云南文山是三七的道地产区，常年种植面积及产量均占全国的60%以上[3]。三七属多年生植物，生长环境温暖阴湿，导致病虫害问题十分严重。目前生产上三七病虫害防治大多依赖化学农药，但三七上的登记用药与实际生产用药严重失衡，大部分农药的使用均无科学的用药依据，导致三七中农药残留失控，给食品安全及生态环境安全带来巨大风险[4-5]。另一方面，欧盟、美国、日本、韩国等发达国家对进口中药材及保健品提出了严苛的农残限量指标，并以此作为贸易技术壁垒限制药材进口，三七产品出口面临着严峻的挑战。因此开展农药田间规范残留试验，研究其在三七中的降解行为及残留水平，并进行膳食摄入风险评估，对制定三七中的农药残留限量标准及指导三七生产安全合理用药具有重要意义。【前人研究进展】通常情况下，通过茎叶施用的农药会附着于作物表面或被作物吸收，通过自然滴落、雨水冲刷等方式进入环境中，并发生迁移、代谢、富集等一系列生化过程[6]。目前，关于农药在三七及环境中的降解行为及残留特征的研究报道较少，仅涉及苯醚甲环唑[7]、多菌灵[8]及百菌清[9]等使用较普遍的农药。【本研究切入点】氟啶胺(Fluazinam，图1)是一种新型取代苯胺类保护性杀菌剂，通过阻断病菌能量(ATP)的形成而使病原物死亡，被用于多种作物的病害防治，且同市面上的大多数杀菌剂无交互抗性[10-11]。但氟啶胺被报道对人体有潜在威胁，可引发哮喘病、皮炎等免疫系统疾病[12]。根据农业部小作物农药登记专项和国家农药残留限量标准小作物补点专项项目组调查，氟啶胺对三七圆斑病、黑斑病等病害均有良好的防治效果。目前，关于氟啶胺的残留行为研究主要集中在菊花[12]、黄瓜[13]、马铃薯[14]、辣椒[15]、葱[16]等作物中，其在三七及环境中的残留行为及安全性尚不明确。【拟解决的关键问题】本文在前人建立的方法基础上[11-17]，采用超高效液相色谱—串联质谱(UPLC-MS/MS)建立了氟啶胺在三七和土壤基质中的残留定量分析方法，通过开展田间试验，跟踪监测了氟啶胺在三七茎叶、根部及土壤中的转移、降解和富集过程，并建立相应降解模型；
研究了不同施药影响因子条件下氟啶胺在三七主要药用部位块根、须根及花中的残留特征，开展膳食摄入风险评估，以期为三七上的合理用药奠定科学基础。

图1 氟啶胺结构式Fig.1 Structural formula of fluazinam

1.1 仪器与试剂

Waters I-Class ACQUITY 超高效液相色谱仪和Xevo TQD 三重四极杆串联质谱仪(美国Waters公司)；
TARGIN VXIII多管涡旋振荡仪(北京踏锦科技有限公司)；
LXJ-IIB 低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；
SIGMA 1-14 离心机(德国Sigma公司)；
BUCHI R-200旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；
TM-767III搅拌机(中山海盘公司)。

氟啶胺标准品(Fluazinam，CAS号：79622-59-6,德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)：纯度99.5%；
50%氟啶胺悬浮剂(50% fluazinam suspension，深圳诺普信农化股份有限公司)；
乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；
甲酸(色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司)；
氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳(GCB,上海安谱实验科技股份有限公司)；
纯水(屈臣氏蒸馏水)；
0.22 μm微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司)。1000 mg/L氟啶胺标准溶液配制：准确称取氟啶胺标准品0.01 g(精确至0.0001 g)于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，转入棕色储液瓶中保存备用。

1.2 分析检测

1.2.1 样品制备 干燥的块根、须根和三七花样品用植物粉碎机粉碎，过40目筛 (孔径425 μm)，混合均匀；
冷冻的鲜植株和根系样品加入适量干冰用植物粉碎机打成粉状，混合均匀，开口放置于冷冻条件下待干冰完全挥发；
土壤样品去除杂物后混合均匀。

1.2.2 提取 称取5.0 g(精确到0.1 g)样品于50 mL离心管中，加入纯水(干样10 mL、鲜样5 mL)，再加入乙腈25 mL，涡旋提取10 min；
加入NaCl 8 g，涡旋1 min后以3000 r/min离心5 min，待净化。

1.2.3 净化 移取1.0 mL上层清液于装有PSA 50 mg和GCB 15 mg的2 mL离心管中(土壤样品为50 mg PSA)，涡旋1 min后以10 000 r/min的速率离心3 min，用1 mL针管移取上清液经0.22 μm有机系滤膜过滤后转移至进样瓶中，用UPLC-MS/MS测定。

1.2.4 UPLC-MS/MS检测条件 超高效液相系统(UPLC)条件：Acquity UPLC BEH C18柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)，柱温35 ℃，进样体积1.0 μL，流动相为甲醇(A)和水(B)，流速为0.4 mL/min，流动相梯度为：0～2.00 min，10%～90%A；
2.00～4.00 min，90%A；
4.00～4.10 min，90%～10%A；
4.10～7.00 min，10%A。

串联质谱(MS/MS)条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子扫描，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度400 ℃；
脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，脱溶剂气流量800 L/h，锥孔气流量50 L/h；
碰撞气为高纯氩气；
采用多重反应监测模式(MRM)，以定量离子对、定性离子对和保留时间定性，以无干扰、响应高的定量离子对定量，质谱参数见表1。

1.2.5 标准曲线 取空白样品，按照上述前处理方法提取、净化得到空白基质溶液，将氟啶胺标准溶液分别用乙腈和空白基质溶液逐级稀释配制为质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L的系列标准溶液，按照上述仪器条件检测，以氟啶胺的质量浓度和对应峰面积绘制标准曲线。

1.2.6 检测方法确证 检测方法的确证包括对方法的线性范围、基质效应、特异性、准确性、重复性及灵敏度(定量限)的考察和确证，其中方法特异性通过对比空白样品色谱图与标准溶液色谱图，确认在目标物出峰处无杂质干扰；
准确性及重复性通过添加回收试验确证，在空白样本(三七块根、须根、植株、根系、花及土壤)中分别添加3档水平的氟啶胺标准溶液，每档添加水平重复5次，按上述前处理及检测方法检测样品，以平均回收率评估方法准确性及相对标准偏差(RSD)评估方法重复性；
方法的定量限为采用添加方法能准确检测的目标物最低浓度；
基质效应(ME)为基质与溶剂标准曲线的斜率比，当ME在0.9～1.1时，表示基质效应不明显，低于或超过该范围则表示基质减弱/增强效应。

1.3 田间试验

田间试验按照NY/T 788—2004《农药残留试验准则》[18]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[19]进行试验设计，于2018年8—10月在云南省曲靖市沾益区、昆明市石林县、红河州弥勒市、文山州丘北县进行，包括残留消解试验及最终残留试验，试验信息见表2。选择地势平整，作物长势良好的三七地块进行田间试验，供试作物为三年生三七，采用标准遮荫棚设施栽培，试验安排在三七第3年生育期，试验期间进行正常的田间管理，不施用目标农药。将试验区划分为面积为15 m2的小区，每种处理重复3次，另设空白对照区。

1.3.1 消解动态试验 将50%氟啶胺悬浮剂按375 g a.i./hm2茎叶喷雾施药1次，分别于施药后当天(2 h)、1、3、5、7、14、21、30、45和60 d采集三七植株、鲜三七根、0～10 cm深根际土壤样品。每次每小区采用棋盘法采挖三七10～15株，分为植株和根系，再采集三七根系附近0～10 cm深土壤样品约1 kg，同时将根系上附着的泥土刮下，合并装入聚乙烯封口袋中，植株部分切成约1 cm小段，根系部分用清水洗净后切片，分别放入聚乙烯封口袋中。在附近选择一块墒情适中的地块，将三七拔除，单独进行土壤消解试验，按相同的施药剂量施药，并在相同间隔期采集0～10 cm深土壤样品约1 kg，放入聚乙烯封口袋中。所有样品均置于<-18 ℃条件下冷冻保存。

1.3.2 最终残留试验 将50%氟啶胺悬浮剂按不同施药剂量、施药次数喷施于三七植株，并在不同采收间隔期采集样品。分别设低剂量(最高推荐剂量，有效成分250 g/hm2)及高剂量处理区(1.5倍最高推荐剂量，有效成分375 g/hm2)，施药3次和4次，施药间隔期7 d，末次施药后5、7、14 d采集三七花样本，7、14、21 d采集三七根样本。每小区每次采用棋盘法采集三七新鲜蓓蕾约200 g，摊开，用远红外灯照射(表面温度40～50 ℃)至含水量≤13%(约1～2 d，期间不定时翻动)，装袋密封；
采挖10～15株生长正常、无病害、成熟的三七全株，清理根部泥土，剪弃地上部分植株，根系洗净后分为块根和须根，块根切片后与须根分别用远红外灯照射(表面温度40～50 ℃)至含水量≤13%(约2～3 d，期间不定时翻动)，装袋密封；
所有样品均置于<-18 ℃条件下冷冻保存。

1.4 数据分析

为保证检测结果的准确性，采用基质标准曲线—外标法对试验样品进行定量，按下式计算样品中氟啶胺的残留量。

(1)

式中，C为残留量(mg/kg)；
A为样品峰面积；
V为提

表1 氟啶胺串联质谱参数

表2 试验点信息

取溶液的体积(mL)，m为样品质量(g)，b为标准曲线截距，a为标准曲线斜率。

氟啶胺的降解趋势采用一级反应动力学方程计算。

Ct=C0e-kt

(2)

式中,Ct为农药残留量(mg/kg)；
C0为农药原始残留量(mg/kg)；
k为降解系数；
t表示施药后时间(d)。

半衰期t1/2表示农药残留量消解一半所需要的时间。

(3)

式中,k表示消解系数。

氟啶胺的膳食摄入风险以风险概率RQ(%)表示[20-21]。

NEDI=∑(STMRi×Fi)

(4)

(5)

式中,NEDI为农药的国家估算每日摄入量(mg)；
STMRi为农药在特定食品中的残留中值(mg/kg)，如果没有残留中值则用相应的MRL值代替；
Fi为该食品的一般人群消费量(kg)；
式(5)中b.w.为人体重(kg)；
ADI为每日允许摄入量(mg/kg bw)。RQ为一般人群摄入该农药的风险概率，当RQ≤100%时，认为对一般人群无健康风险，比值越小风险越低。

2.1 前处理方法优化

在前人建立的前处理方法基础上[12,17]，重点考察了不同净化方法—分散固相萃取法(d-SPE)、固相萃取法(SPE)及不同净化剂的净化效果，并以方法的回收率及基质效应进行对比评价。以三七块根为例，在空白样品中添加氟啶胺标准溶液使添加浓度为0.2 mg/kg，静置30 min后，采用1.2.2的方法提取，取上清液用不同的方法净化。结果如图2所示，柱形图表示方法的回收率，灰色方框内为可接受回收率70%～110%，而三角符号表示方法的基质效应(ME)，红线位置表示ME为1即无基质效应，回收率符合要求的前提下基质效应越低表示干扰越少，净化效果越好。从图2可看出，未净化的样品溶液呈基质增强效应(ME>1.1)，样品净化后基质效应有不同程度的降低，其中以采用PSA/C1850 mg+GCB 15 mg、PSA/C1850 mg+GCB 15 mg+无水MgSO4150 mg为净化剂的d-SPE法和采用氨基柱(NH2)的SPE法的基质效应最低，净化效果最好；
但SPE法操作复杂，需要使用较多的有机溶剂，且氨基柱会吸附目标物，无法洗脱(回收率接近0)。综合几种基质的净化对比结果后，最终决定采用以PSA 50 mg + GCB 15 mg(土壤样品用PSA 50 mg)作为净化剂的分散固相萃取法对样品提取液进行净化，该方法操作简便，方法技术指标均满足残留分析的要求。

图2 不同净化条件下添加氟啶胺0.2 mg/kg于三七块根的净化效果对比(n=3)Fig.2 Comparison of purification efficiency of adding 0.2 mg/kg fluazinam in P. notoginsengroot tuber under different clean-upconditions (n=3)

2.2 分析方法的确证

如图3所示，以三七块根为例，通过对比基质空白样品与标准溶液及添加样品色谱图可确定在空白样品中目标物出峰处的干扰峰的响应值低于最低添加浓度响应值的30%，因此对样品检测无影响。方法的关键技术参数列于表3中，在0.002～0.200 mg/L(植株为0.002～1.000 mg/L)浓度内，氟啶胺在三七块根、须根、植株、根系、花及土壤基质中均呈现良好的线性关系，相关系数大于0.99；
基质效应均不显著，在0.9～1.1内；
定量限为0.01～0.02 mg/kg。添加回收结果表明，氟啶胺在所有基质中的回收率在82%～103%，RSD为1%～13%，准确度及精密度均符合农药残留分析的要求。

A：三七块根基质氟啶胺标准溶液0.002 mg/L；
B：三七块根空白对照；
C：三七块根添加氟啶胺0.01 mg/kgA: The 0.002 mg/L fluazinam matrix-matched standard solution of P. notoginseng root tuber; B: The blank control of P. notoginseng root tuber; C: The 0.01 mg/kg sample of fluazinam in P. notoginseng root tuber图3 氟啶胺在三七块根中的添加回收色谱图Fig.3 Chromatograms of fortified samples of fluazinam in P. notoginseng root tuber

2.3 消解动态试验

2.3.1 氟啶胺在三七体系中的消解动态 2个试验点氟啶胺在三七体系中的消解动态曲线如图4～5所示。施药后2 h氟啶胺在三七植株中的原始沉积量分别为36.2(沾益)和31.1 mg/kg(弥勒)，残留量随间隔期延长逐渐降低，7 d降解率55%～60%，30 d后降解率99%以上，消解动态符合一级动力学模型，降解方程为C=27.332e-0.106t，r=0.9824(沾益)和C=22.6e-0.094t，r=0.9545(弥勒)，半衰期分别为6.5和7.4 d。施药后2 h氟啶胺在根际土壤中即能被检测到，原始沉积量为0.046～0.053 mg/kg，之后残留量逐渐升高，分别于施药后14(沾益)和5 d(弥勒)达到峰值，为0.45和0.22 mg/kg，残留量随时间呈波动性降解，60 d后均低于0.05 mg/kg，降解趋势不符合一级动力学模型。氟啶胺在根系中的原始沉积量为0.033～0.057 mg/kg，之后残留量逐渐升高，分别于5(沾益)和14 d(弥勒)达到第1个高峰0.098～0.110 mg/kg，于21(沾益)和30 d (弥勒)达到第2个高峰0.068～0.16 mg/kg，降解趋势不符合一级动力学方程。氟啶胺在土壤中的原始沉积量为0.23～0.61 mg/kg，之后残留量在14 d内(沾益)和21 d(弥勒)内随时间的推移逐渐降低，分别降解49%和86%，之后残留量呈波动性降解，60 d后降解86%～89%，拟合降解方程分别为：C=0.5715e-0.023t，r=0.782(沾益)；
C=0.2139e-0.033t，r=0.7359(弥勒)，半衰期分别为30.1和20 d。

图4 沾益试验点氟啶胺在三七体系中的消解动态曲线(n=3)Fig.4 Dissipation dynamic curves of fluazinam in P. notoginseng systemin Zhanyi (n=3)

图5 弥勒试验点氟啶胺在三七体系中的消解动态曲线Fig.5 Dissipation dynamic curves of fluazinam in P. notoginseng systemin Mile (n=3)

表3 方法的线性范围、相关系数、基质效应、平均回收率、相对标准偏差(n=5)及定量限

氟啶胺为保护性杀菌剂，本身不具有内吸传导性，喷施后氟啶胺药剂主要附着于三七地上部分茎叶上，到达地下部分的药剂量较低；
此外，氟啶胺在根际土壤中的最大残留量分别为沾益14 d时的0.45 mg/kg以及弥勒5 d时的0.22 mg/kg，约为直接喷施于土壤中的最大沉积量的63%～70%，由此可推断喷施于作物的大部分药剂最终将进入土壤，至少占喷施总量的60%以上。氟啶胺在三七根系中的残留量分别为0.057～0.160 mg/kg(沾益)和0.022～0.098 mg/kg(弥勒)，说明虽然氟啶胺不具有内吸性，但有一定的渗透性，进入土壤中的氟啶胺药剂可通过渗透扩散作用进入三七根系中，而沾益的残留水平高于弥勒，这可能与土壤中的微生物群落及其对药剂的利用降解能力有关，在弥勒土壤中氟啶胺的降解半衰期更短、降解速率更快，因此最终进入三七根系中的药剂量更少，表现为更低的残留水平。

2.4 最终残留试验

最终残留试验结果表明，4个地点三七花中氟啶胺的最终残留量为0.015～0.860 mg/kg，三七块根为0.045～0.750 mg/kg，须根为0.029～0.920 mg/kg。不同施药因子下氟啶胺在不同基质中的残留分布如图6～8所示，增大施药剂量，三七花和块根中的残留量均显著增加(P<0.01)，但在三七须根中差异不显著(P>0.05)；
而增加施药次数，3种基质中的残留变化均不显著(P>0.05)；
此外，随着采收间隔期的延长氟啶胺在三七花中表现为7 d内显著降低(P<0.001)，而7～14 d轻微升高(P>0.05)，究其原因可能与农药性质有关，氟啶胺虽无内吸传导性，但具有一定渗透扩散性，在施药初期附于植株(三七花)表面的药剂受滴灌水或雨水冲刷而进入土壤，残留量大幅降低，随着时间的推移，药剂逐渐渗透吸附于植株表皮，因此残留量变化趋于稳定。三七块根和须根中的氟啶胺残留随采收间隔期变化不显著(P>0.1)，氟啶胺主要通过根际土壤渗透进入三七根系中，同时伴随渗透、扩散、富集和降解行为，过程受土壤性质和微生物影响，因此随采收间隔期波动不明显。

图6 不同施药剂量下三七中氟啶胺最终残留量Fig.6 The final residues of fluazinam in P.notoginseng at different doses

图7 不同施药次数下三七中氟啶胺最终残留量Fig.7 The final residues of fluazinam in P.notoginseng at different application times

图8 不同采收间隔期三七中氟啶胺最终残留量Fig.8 The final residues of fluazinam in P.notoginseng at different harvesting intervals

2.5 膳食摄入风险评估

氟啶胺ADI值为0.01 mg/kg bw[22]。根据中国农药信息网氟啶胺在中国的登记使用情况，结合中国居民人均膳食结构调查数据[23]、农药毒理学数据以及本研究获得的规范残留试验中值(表4)，以收获期21 d三七须根中氟啶胺残留中值数据进行风险评估。结果如表5所示，氟啶胺的国家估算每日摄入量(NEDI)为0.45 mg，每日允许摄入量为0.63 mg，风险概率为71.4%，说明50%氟啶胺悬浮剂按照推荐剂量在三七上施用，对消费者的慢性膳食摄入风险在安全范围内。

表4 氟啶胺在三七花、块根、须根中的最终残留量

表5 氟啶胺膳食摄入风险评估结果

3.1 氟啶胺在三七中的消解动态

目前，已有对氟啶胺在马铃薯[11,14]、菊花[12]、黄瓜[13]、辣椒[15]、葱[16]等作物中的残留消解研究报道，研究表明氟啶胺在这些作物上的降解均较快，半衰期为1.0～8.7 d，属于易于降解的农药，与本研究结果相似。但是报道的氟啶胺在土壤中的降解速率差异较大，氟啶胺在土壤中降解主要依靠土壤微生物分解，受土壤pH、湿度、有机质含量及土壤微生物影响[24]，因此存在明显的地区差异。此外，分析苯醚甲环唑[7]、多菌灵[8]及百菌清[9]在三七中的降解行为可知，内吸性杀菌剂苯醚甲环唑和多菌灵可迅速被三七植物吸收并传导至地下根部，施药后3 d内地下根部残留量达到峰值，且残留较高(约为0.7 mg/kg)，远高于非内吸性农药百菌清及氟啶胺。

3.2 氟啶胺在收获期三七中的残留水平

最终残留试验表明，施药后7 d内三七花中氟啶胺残留大幅降低，之后残留则变化较小，因此三七花的采收间隔期宜在施药7 d以后。氟啶胺在三七根中的残留量在施药后21 d内变化幅度较小，氟啶胺不具有内吸传导作用，大部分药剂将残留于地上部分及土壤环境中，到达地下根部的残留较少，但由于三七收获后要进行干制处理，脱水后作物中的农药经过浓缩富集，因此在三七干样中残留较高，这一现象在其他干制作物中也有类似的现象[12]。目前中国制定氟啶胺在三七块根中的MRL值为1 mg/kg，三七须根中的MRL值为2 mg/kg[22]，推荐安全采收间隔期为7 d。

采用超高效液相色谱—串联质谱(UPLC-MS/MS)建立了三七和土壤基质中氟啶胺残留的提取定量方法。氟啶胺在三七植株上的半衰期为6.5～7.4 d，在土壤中的半衰期为20.0～30.1 d，在根际土壤和三七根系中的消解不符合一级动力学反应模型，呈先升高后波动性降解的趋势。50%氟啶胺悬浮剂分别按250和375 g a.i./hm2的剂量喷雾施药3和4次，施药间隔7 d，施药后7、14、21 d三七块根中氟啶胺的残留量均<1 mg/kg，三七须根中氟啶胺的残留量均<2 mg/kg，推荐安全采收间隔期(PHI)7 d。膳食摄入风险评估结果显示，氟啶胺的风险概率(RQ)为71.4%，风险在安全范围内。