基于Illumina,MiSeq测序技术分析大鲵肉冷藏过程中微生物菌群演替规律

赵 萍，金文刚,3, ，兰阿峰，刘俊霞，裴金金，陈德经,3

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，秦巴生物资源与生态环境省部共建培育国家重点实验室，陕西 汉中 723001；
2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；
3.陕西理工大学 陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723001）

大鲵（）是我国人工养殖成熟的重点水产动物品种之一，已在多个省、市实现了规模化人工养殖，其食用和药用价值极高，含有丰富的氨基酸、人体必需脂肪酸、矿物质、微量元素及维生素。随着大鲵养殖规模的不断扩大，商品鲵价格不断下跌，给养殖企业、养殖户造成了较大经济损失，大鲵精深加工与开发利用已成为制约产业发展的瓶颈。迄今，研究人员已在大鲵营养评价、分割加工与贮藏保鲜、生物活性成分、热加工方便食品等方面进行了较多尝试，促进了一些高附加值产品的上市以及产业链的延伸。目前，大鲵低温肉制品（冷鲜和速冻肉）已成为最重要的初加工产品形态，但冷鲜肉存在易腐败变质、货架期短的缺陷。肉类腐败变质主要是由微生物的生长繁殖导致，而引起腐败变质的菌群主要为少数优势特定腐败菌。查明并抑制引起大鲵肉腐败变质的优势菌群，是冷藏过程中实现品质控制和延长货架期的根本。

Illumina MiSeq高通量测序技术是研究微生物多样性的一种分子生物学手段，该技术以细菌基因序列信息为基础，通过细菌的基因序列研究水产品贮藏过程中微生物（尤其是优势腐败菌）的组成及变化。传统的微生物群落多样性研究，主要是通过生理生化实验及表型进行鉴定，耗费时间且不能对其进行精确鉴定，难以获得微生物群落多样性变化的真实情况。与传统研究方法相比，Illumina MiSeq高通量测序技术具有无需分离纯化、测定速度快、结果精准、利用微量样品就能实现所有微生物检测、安全性和自动化程度高、分析全面等优点。其中16S rDNA被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标，通常作为揭示生物物种的特征核苷酸序列，16S rDNA扩增子测序是对高变区进行测序分析和菌种鉴定，既可以提高效率还可以节约成本。目前，高通量测序技术已成功应用于深水玫瑰虾、鲷鱼、贻贝、鲳鱼等水产品低温贮藏过程中微生物多样性分析。

随着大鲵分割加工的产业化推进，有关大鲵分割肉气调包装、冰藏和微冻贮藏理化品质指标的研究已有报道。冷鲜肉被誉为21世纪鲜肉消费的主流，课题组前期对大鲵肉冷藏过程中主要理化指标和挥发性成分进行了初步探讨，然而大鲵肉冷藏过程中微生物菌群组成和特定腐败菌的研究，还鲜见报道。为此，本研究采用高通量测序技术探究大鲵肉冷藏期间微生物菌群演替规律，旨在为后期靶向抑菌及冷藏保鲜奠定基础。

1.1 材料与试剂

鲜活健康子二代大鲵3 尾（（2.51±0.36）kg），购自陕西汉中龙头山水产养殖开发有限公司大鲵生态养殖基地。

三氯乙酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
甲基红、亚甲基蓝 北京鼎国生物技术有限责任公司；
氧化镁天津市百世化工有限公司；
硼酸 天津市福晨化学试剂厂；
盐酸 杭州汇普化工仪器有限公司；
琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司；
Qubit dsDNA Assay Kit试剂盒美国Life Technologies公司；
Magpure Soil DNA LQ Kit试剂盒 广州Magen公司；
Tks Gflex DNA ploymerase试剂盒 宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

AD18型分散均质机 上海昂尼仪器仪表有限公司；
SW-CJ-IFD型洁净工作台 上海博迅实业公司；
LQ-C1003型电子天平 深圳市飞亚衡器有限公司；
FA3204B型电子天平 上海精科天美科学仪器有限公司；
COHS-250型生化培养箱 常州金坛良友仪器有限公司；
Centrifuge 5418型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；
580BR10905型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；
SN 002358型QIAxtractor高通量核酸提取仪 德国QIAGEN公司；
2100型生物分析仪 美国Aglient公司；
2000型NanoDrop微量分光光度计 美国Thermo Fisher公司；
2500型凝胶成像仪 北京Tanon公司。

1.3 方法

1.3.1 大鲵肉样品的制备

鲜活大鲵经放血、热烫、刮黏液、去内脏和清洗后，用聚乙烯袋20 min内运回实验室，去头、皮、四肢、尾，并切成约5.0 cm×2.0 cm×0.5 cm的肉块，放入黑色托盘中并用保鲜膜密封4 ℃冷藏，于宰后第0、2、4、6、8天取样，每个时间点取6 个平行，分别记为T0（T0-1、T0-2、T0-3、T0-4、T0-5、T0-6），T2、T4、T6、T8的标记与T0相似，定时将样品取出，置于超净工作台上，去除保鲜膜，用事先灭菌好的剪刀将肉样剪碎，混匀，用镊子装在15 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱中贮藏，用于细菌菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）测定和高通量测序。

1.3.2 细菌菌落总数和TVB-N测定

按照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》和GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》方法，对不同冷藏时间大鲵肉中菌落总数和TVB-N含量进行测定。

1.3.3 高通量测序

将制取的不同冷藏时间大鲵肉样本用干冰保存运送至上海欧易生物医学科技有限公司，基于Illumina MiSeq平台进行高通量测序。

1.3.3.1 基因组DNA提取

按照Magpure Soil DNA LQ Kit试剂盒说明书提取样本的基因组DNA，在2 mL的离心管中，加入约500 mg的玻璃珠，再加入0.25～0.5 g大鲵肉样品和0.6～0.8 mL Buffer SOL，在涡旋仪上以最高速度涡旋5～10 min，再加入60 μL Buffer SDS至样品中，涡旋混匀30 s，详细提取方法按照试剂盒说明书进行。之后利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000微量分光光度计检测DNA浓度。

1.3.3.2 PCR扩增与建库

以基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，TaKaRa公司的Tks Gflex DNA polymerase进行1轮PCR，确保扩增效率和准确性。第1轮PCR产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为2轮PCR模板，并进行2轮PCR扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并利用Illumina Novaseq 6000测序系统上机测序。细菌多样性鉴定对应区域16S V3-V4区。引物序列：343F 5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′；
798R 5′-AGGGTATCTAATCCT-3′。

1轮PCR体系：15 μL 2×Gflex PCR Buffer、1 μL 5 pmol/μL Primer F、1 μL 5 pmol/μL Primer R、≥1 μL（50 ng）Template DNA、0.6 μL TKS Gflex DNA Polymerase（1.25 U/μL），加水补足至30 μL。PCR程序：94 ℃预变性5 min，循环1 次；
94 ℃变性30 s；
56 ℃退火30 s，循环26 次；
72 ℃延伸20 s；
72 ℃延伸5 min，循环1 次；
4 ℃保藏。

2轮PCR体系：15 μL 2×Gflex PCR Buffer、0.6 μL TKS Gflex DNA Polymerase（1.25 U/μL）、1 μL Adapter I5、1 μL Adapter I7、50 ng第1轮产物，加水补足至30 μL。PCR程序：94 ℃预变性5 min，循环1 次；
94 ℃变性30 s；
56 ℃退火30 s，循环7 次；
72 ℃延伸20 s；
72 ℃延伸5 min，循环1 次；
4 ℃保藏。

1.4 数据统计

测序完成后，使用Trimmomatic软件对原始双端系列进行去杂，去杂后的双端系列利用FLASH软件进行拼接。为保证结果的准确性，可进行精准去杂，去除含有模糊碱基、单碱基高重复区的序列与及长度过短的序列，同时，利用UCHIME软件检测并去除序列中的嵌合体。处理后形成的有效序列，采用Vsearch软件，根据序列的相似性，将相似度≥97%的序列归为多个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。使用QIIME软件包挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行对比注释。16S使用Silva（version132）数据库对比，物种对比注释使用RDP classifier软件，保留置信区间＞0.7的注释结果，物种比对注释使用BLAST软件。基于分类信息学，探讨大鲵肉在冷藏期间微生物群落结构变化。使用Excel对原始数据进行处理、汇总，采用SPSS 25进行显著性分析，其中多重比较采用Duncan法，＜0.05，差异显著，利用Origin 2021进行绘图。

2.1 大鲵肉冷藏过程中菌落总数和TVB-N值的变化

通常水产鱼类菌落总数≥6（lg（CFU/g））时达到腐败，由图1A可知，随着冷藏时间的延长，菌落总数总体呈上升的趋势，在0～4 d增加缓慢，4～8 d增加较快，在第6天超过水产品可接受的上限，第8天达到最大值8.41（lg（CFU/g）），已经超出了可食用水产品的微生物阈值。在冷藏初期，菌落总数增长速率较慢，主要是低温、pH值的降低与及初始腐败菌落数较低。随着冷藏时间的延长，菌落总数增长速率加快，主要是由于蛋白质的自溶及代谢物的积累有利于腐败菌的生长繁殖。TVB-N是由具有挥发性的氨、伯胺、仲胺及叔胺等低级碱性含氮化合物组成，主要是由于食品在酶和微生物的作用下，使蛋白质及非蛋白的含氮化合物降解产生氨及胺类等挥发性碱性含氮化合物。根据G B/T 18108—2008 规定，鱼肉中TVB-N 值达到30 mg/100 g，是消费者可接受的上限，由图1B可知，大鲵肉在冷藏期间TVB-N值呈增加的趋势，在前4 d增加缓慢，TVB-N值由6.61 mg/100 g增加到12 mg/100 g，之后快速增加并在第6天接近可接受上限，在第8天超出可接受上限达到最大值47.8 mg/100 g。大鲵肉在发生自溶生化变化前期，蛋白质降解速度较慢，引起蛋白质降解的主要因素为内源酶，在自溶阶段，蛋白质的分解为微生物的生长繁殖提供了营养物质，使得微生物迅速增长，然后微生物产生各种蛋白酶作用于蛋白质，又使得蛋白质分解，所以在自溶阶段后TVB-N值迅速增加。

图1 大鲵肉冷藏过程中菌落总数（A）和TVB-N值（B）的变化Fig.1 Changes in total bacterial count (A) and TVB-N content (B) of giant salamander meat during cold storage

2.2 PCR扩增结果

如图2所示，所有样品的PCR扩增产物条带介于750～500 bp之间，特异性和亮度较好，无副带和拖带，说明各样品纯度较高，PCR扩增条件合适，可用于后续的高通量测序分析。

图2 PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretograms of PCR-amplified products

2.3 测序样本数据分析

高通量测序获得不同冷藏期大鲵肉30 个样品原始DNA序列，经质控和优化后得到有效序列，相关信息见表1。可知，不同冷藏期样品的有效序列数均在40 000以上，有效序列百分比达73%以上，平均长度范围为412.55～425.01 bp，表明样本的有效序列满足后续微生物多样性分析要求。

表1 样品测序信息Table 1 Results of sample sequencing

将有效序列按照97%的相似度进行OTU分类，并选取每个OTU中丰度最大的序列为该OTU的代表序列，绘制Venn图，如图3所示。0、2、4、6、8 d样品中共有的OTU数分别为3 016、3 040、1 979、1 456、1 576，独有的OTU数分别为715、721、119、24、37；
而0 d-2 d、2 d-4 d、4 d-6 d、6 d-8 d中共有的OTU数分别为1 985、1 629、1 165、1 056。随着冷藏时间的延长样本中总OTU数呈降低的趋势，且后三个时间段显著降低，说明冷藏前期大鲵肉的微生物多样性可能比冷藏后期更丰富，一些微生物只能在富氧的环境中生存。同时样本中独有的OTU与总OTU变化趋势相似，但前后时间段之间共有OTU变化幅度较小，说明大鲵肉在冷藏过程中其菌群结构变化很大，但主要菌群变化较小。根据OTU的特点能将5 个时间段划分为3 个区间，即冷藏前期（0、2 d）、冷藏中期（4 d）、冷藏后期（6、8 d），各区之间变化显著。

图3 样品中微生物群落共享和独有的OTU Venn分析Fig.3 Venn analysis of shared and unique OTUs of microbial communities between samples

2.4 α多样性分析

多样性是根据97%相似度水平下的OTU信息，通过Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数等对样品微生物物种丰富度和多样性进行评估。Chao1指数反映样品的菌群丰度，估计群落中含OTU的数目；
Shannon指数和Simpson指数反映样品中微生物群落的多样性，Shannon指数越大，说明群落多样性越高，Simpson指数则与之相反，值越大，说明群落多样性越低。本研究得到的大鲵肉不同冷藏时间样品多样性相关指数如表2所示。不同冷藏时间样本中微生物的覆盖率均大于99%，表明测序结果可以反映实际情况。在0 d时Chao1指数最大，表明此时菌群丰度最高，随着冷藏时间的延长，Chao1指数逐渐降低，说明微生物的丰富度逐渐降低，且冷藏中、后期较前期降低显著（＜0.05）。随着冷藏时间的延长，Shannon指数逐渐降低，Simpson指数则与之相反，表明大鲵肉的微生物菌群多样性逐渐降低。冷藏前期氧含量充足、微生物生长繁殖所需的营养物质较少、同时各种微生物存在生存适应阶段，因此，在冷藏前期微生物丰度和多样性较高；
随着冷藏时间的延长，环境中氧含量降低、蛋白质等大分子物质在内源酶和外源酶的作用下降解，为微生物的生长繁殖提供充足的营养物质、优势物种大量繁殖并产生代谢物和毒素等，引起部分物种死亡导致冷藏后期微生物多样性和丰富度降低，与Huang Wenbo等的研究结果相似。

表2 样品微生物多样性指数Table 2 Microbial diversity indexes of samples

图4A为样本物种累积曲线，用于描述随着抽样量的增大物种增加状况，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度估计，随着抽样量的增加，曲线趋于平缓，表明此环境中的物种并不会随着样本量的增加而显著增多，抽样充分。图4B为样本Rank Abundance曲线，用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富度（指一个群落或生境中物种数目的多寡）和均匀程度（指一个群落或生境中全部物种个体数目的分布均匀程度），物种丰富程度由曲线在横坐标上的长度反映，曲线越宽（横轴的跨度越大），表示物种的组成越丰富；
物种组成的均匀程度由曲线的形状反应，曲线越平坦（纵轴的跨度越大），表示物种组成的均匀程度越高。由图4B可知，随着OTU数量的增多，曲线逐渐平坦，表示样本中物种组成均匀度逐渐提高，即冷藏前期较冷藏中、后期物种丰富度和多样性高。

图4 样本物种累积曲线（A）和Rank Abundance曲线（B）Fig.4 Species accumulation curves (A) and Rank Abundance curves (B)

2.5 群落多样性分析

2.5.1 样品在门水平上的多样性

如图5所示，在门分类水平上，0、2 d中主要菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度均在3 7%～4 2%之间；
其次为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度分别为14.2%、11.2%；
Fibrobacteres、Actinobacteria、Spirochaetes相对丰度在3%～1%之间，其他菌门相对丰度均小于1%。4、6、8 d较0、2 d变化显著，绝对优势菌门为变形菌门，相对丰度在84.7%以上，显著高于冷藏前期，而拟杆菌门、厚壁菌门，相对丰度在7%～2%之间，显著低于冷藏前期，其他菌门均小于1%。变形菌门中包含水产品常见的腐败菌，如希瓦氏菌属、假单胞菌属。总而言之，在整个冷藏过程中，拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门为优势菌门，说明这3 种微生物对大鲵肉的品质起着重要作用，从门水平上讲，细菌的种类大致相同，而丰度差别比较大。

图5 样本中微生物在门水平相对丰度分布Fig.5 Relative abundance and distribution of microorganisms in samples at the phylum level

2.5.2 样品中细菌在属水平上的多样性

为细化研究不同样品中微生物多样性的差异，进一步在属水平上分析大鲵肉冷藏过程中细菌群落多样性。如图6所示，0、2 d中主要菌属为拟杆菌属（），相对丰度分别为17.6%、19.1%，随着时间的延长，相对丰度明显下降，在4、6、8 d相对丰度分别下降至2.8%、0.7%、1.3%；
其次为，相对丰度分别为8.5%、9.1%，在冷藏中后期丰度均低于1.5%，显著下降；
其余菌属相对丰度均小于1%。而在4、6、8 d中假单胞菌属（）为绝对优势菌属，相对丰度分别为43.5%、56.4%、47.8%，较冷藏前期大幅增加，说明冷藏后期的条件更有利于其生长；
其次为气单胞菌属（）、相对丰度在10%左右，沙雷氏菌属（）相对丰度在5%左右，在4、6、8 d相对丰度分别为6.4%、1.3%、1.6%，这些菌属较冷藏前期明显增加；
其余均属相对丰度均小于1%。在属水平上，不同冷藏期所含细菌的种类多样性和丰富度存在较大的差异。此外，大鲵肉在冷藏初期，菌群种类极为丰富，随着冷藏时间的延长，物种的种类逐渐减少。

图6 样本中微生物在属水平相对丰度分布Fig.6 Relative abundance and distribution of microorganisms in samples at the genus level

2.6 样本差异分析

基于由物种组成（某些距离矩阵算法也会考虑到物种进化关系）计算得到的距离矩阵进行主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）。如图7A所示，PC1为54.19%，PC2为26.73%，PC1和PC2叠加解释度达80.92%。在所有样品中0、2、8 d组内样本之间距离较小，表明组内微生物群落结构差异较小，且0、2 d组内微生物群落结构相似度较8 d高；
而4 d和6 d组内样品之间距离较大，表明组内微生物结构差异较大，主要是由于菌群在大鲵肉表面分布不均导致。整体看，0、2 d样品之间相互重叠且集中分布在第2象限，8 d样品集中分布在第4象限，4、6 d样品分散在第1、4象限且6 d在第4象限的样品更多，综上表明，0-2、4、6、8 d之间微生物结构差异较大。

图7 样本中微生物群落PCoA（A）和LEfSe分析差异物种注释分支图（B）Fig.7 PCoA analysis (A) and LEfSe analysis of differential species annotated clade (B) of microbial communities in samples

LEfSe分析可以分析组间菌群差异，找出组间差异的微生物种类。如图7B所示，不同颜色表示不同分组，红色节点表示在红色组别中丰度相对较高的差异显著物种，绿色节点表示在绿色组别中丰度相对较高的差异显著物种，黄色节点表示在两组比较中并无显著差异的物种，节点直径大小与相对丰度大小呈正比，每层节点由内向外分别表示门、纲、目、科、属。在微生物门水平上，5 组中差异显著的种类包括5 个，分别是变形菌门、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、厚壁菌门。在微生物属水平上，5 组样本中显著差异的菌属共鉴定出16 个，冷藏前期假黄单胞菌属（）、Rikenellaceae_RC9_gut_group、uncultured_bacterium、9、拟杆菌属、纤维杆菌属（）、毛螺菌属（）、、显著上调。冷藏中期沙雷氏菌属（）、不动杆菌属（）显著上调。冷藏后期气单胞菌属、假单胞菌属、ambiguous_taxa、、1显著上调。

2.7 累加统计分析

如图8所示，A、D两组变化趋势相同，均是冷藏前期丰度较高，中、后期明显下降，A组在5 个冷藏节点的值分别为46.32%、46.17%、7.22%、2.36%、2.99%，D组为51.60%、51.17%、12.72%、7.57%、10.54%。其中，拟杆菌属、9、毛螺菌属为专性厌氧菌，Rikenellaceae_RC9_gut_group为瘤胃微生物主要生活在厌氧环境中，该类菌属，在冷藏初期，贮藏环境中氧含量较高，不利于生长繁殖，在冷藏中后期贮藏环境中氧含量较低，能进行生长繁殖，但不具有生长优势，生长繁殖受到抑制，导致相对丰度明显下降。B组在整个冷藏期间波动相对较小，但在冷藏中期丰度较高，在5 个冷藏节点的值分别为0.46%、0.66%、13.49%、5.42%、6.46%。其中沙雷氏菌属为革兰氏阴性杆状兼性厌氧菌，菌株能产生粉色、红色或深红色色素，对大鲵肉颜色有显著影响，不动杆菌属为革兰氏阴性好氧菌，属于条件致病菌，是机体抵抗力降低时易感染的革兰氏阴性菌，在冷藏中期相对丰度显著增加，表明大鲵肌肉组织自身抗菌活性显著下降，在冷藏后期快速下降，主要是由于假单胞菌属的快速增殖竞争营养成分和产生大量代谢物和毒素，冷藏环境中氧含量降低，对其继续增殖具有抑制作用。

图8 不同菌群累加占比分析Fig.8 Change in relative abundance of different bacterial groups during storage

C组在冷藏中、后期菌群丰度大幅增加，可以判定为主要致腐菌属，在5 个冷藏节点的值分别为1.62%、2.00%、66.57%、84.65%、80.02%。其中假单胞菌属为革兰氏阴性需氧杆状细菌，分解蛋白质的能力极强，容易导致肉类变黏，代谢产物硫化氢、过氧化氢会使肉类变色，生长的最适pH值为7.0～8.5，能利用H和CO作为能源且能在冰箱中生长繁殖，不能在pH值6或6以下生长，是低温贮藏肉制品中常见的腐败菌，其致腐性受群体感应系统的调控。结合图6可知，该菌在冷藏中后期相对丰度显著增加至50%左右，为主要致腐菌属。在大鲵肉发生自溶生化变化前期，蛋白质等大分子降解较少，pH值较低，微生物种类较多，该菌的生长繁殖速度相对较慢；
在自溶阶段及之后，蛋白质等大分子在酶的作用下分解为小分子，贮藏环境中氧含量降低，部分菌种因不适应环境而死亡，pH值逐渐升高，有利于该菌的生长繁殖，导致冷藏中后期大幅增加；
但在第8天相对丰度较第6天略微下降，主要是由于微生物大量生长繁殖，导致代谢物和毒素积累，对自身生长具有抑制作用。气单胞菌属能代谢产生氧化三甲胺和硫化氢，与假单胞菌属类似，是大鲵肉在冷藏过程中变色、发黏并产生不良气味的原因之一，、ambiguous_taxa、1在冷藏中后期相对丰度增加，其中相对丰度值在中后期达到10%左右，但其致腐性有待研究。

2.8 进化分析

系统发育学也称系统发生学，通过某一分类水平上序列间碱基的差异构建进化树能够揭示出有关生物进化过程的顺序，了解生物进化历史和机制，是研究物种形成和进化关系的有力工具。使用FastTree软件绘制组合图，选择丰度在前50的OTU，根据最大似然法构建进化树，并以热图展示OTU在不同样本的丰度。由图9可知，进化树可以分为5 个大的分支，第1个分支为变形菌门中的部分属，主要为假单胞菌属，绝大部分菌属在冷藏中、后期丰度较高，是影响大鲵肉品质的关键菌群。第2个分支主要包括了厚壁菌门中的部分菌属，第3个分支主要包括梭杆菌门中的梭菌属，第4个分支主要包括了纤维杆菌门中的纤维杆菌属，第5个分支包括拟杆菌门中的部分属，主要为拟杆菌属。后4个分支除1，其余菌属均在冷藏前期丰度较高。通过进化分析可知，菌落演替与冷藏时间具有良好的相关性。

图9 TOP 50物种进化树及OTU丰度组合图Fig.9 Phylogenetic tree and OTU abundance combinations of TOP 50 species

2.9 基于16S的KEGG功能预测

京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是有关生物系统比较完善的数据库，关联基因组信息和功能信息的知识库。其由基因蛋白序列（KEGG Genes）、具有内源性和外源性的化学物质（KEGG Ligand）、分子相互作用和代谢通路图（KEGG Pathway）、各种生物之间的层次关系（KEGG Brite）构成。KEGG在L2水平共41 种代谢通路，其中相对丰度值占比居前15的代谢通路如表3所示。可以看出，膜运输、特征差、细胞过程和信号传导、脂代谢、新陈代谢在冷藏中后期表现为增加的趋势。其中膜运输的相对丰度最大，达到13%左右，膜运输包括ABC转运器、磷酸转移酶系统、细菌分泌系统3 条代谢通路，其中，磷酸转移酶系统是细菌吸收碳水化合物的主要机制；
ABC转运器广泛存在于细菌、古细菌和真核生物中，主要是将ATP水解与多种底物主动转运结合起来；
细菌分泌系统在革兰氏阴性细菌中具有高度的保守性。由3 条代谢通路的特性可以看出，膜运输在冷藏中后期丰度的升高，与革兰氏阴性菌的增加密切相关。

表3 KEGG功能预测Table 3 KEGG function prediction

碳水化合物代谢、复制和修复、能量代谢、翻译、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、转录、遗传信息处理、折叠、分类和降解随着冷藏时间的延长均表现为降低的趋势。其中碳水化合物代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢等能为细菌的生长繁殖提供必需的营养物质；
复制与修复、转录、遗传信息处理、折叠等是微生物自身合成遗传物质的主要代谢通路；
该类代谢通路相对丰度的变化趋势与图8中主要致腐菌的变化趋势相反，表明致腐菌的大量增殖和微生物群落结构的变化对代谢通路环境有明显的影响，弓湃等研究指出假单胞菌属中CbrAB-CrcZ-Crc参与碳代谢抑制调控，能为假单胞菌适应环境变化和提高在自然界中的竞争力做出代谢优化调控，赋予假单胞菌相比同一环境中其他微生物而言更多的竞争优势，更有利于假单胞菌在环境中生存。

氨基酸代谢通路在整个冷藏过程中波动较小，氨基酸代谢在微生物演替中的作用主要包括两个方面，一方面是氨基酸的合成代谢，用于合成自身独特的蛋白质、多肽和其他含氮物质，以产生相应的氮源为微生物利用；
另一方面是氨基酸的分解代谢，通过脱氨基、转氨基、联合脱氨基的方式分解为-酮酸、胺类和二氧化碳。其中-酮酸可合成非必需氨基酸、转变为糖及酯类、氧化产生能量；
二氧化碳大部分直接排到细胞外。同时能量代谢中糖酵解和三羧酸循环产生二氧化碳都会导致环境中二氧化碳浓度的升高，有利于兼性厌氧菌属的生长繁殖，是冷藏中后期乳球菌属（）、沙雷氏菌属、拉恩氏菌属（）、柠檬酸杆菌属、希瓦氏菌属等丰度明显增高的主要原因。

通过Illumina MiSeq测序技术对托盘包装大鲵肉冷藏过程中的5 个时期30 个样品进行分析，初步明确了大鲵肉冷藏期间菌相组成及变化规律，主要结论如下：1）大鲵肉在冷藏过程中微生物丰度随着冷藏时间的延长逐渐降低；
门水平分析发现，细菌优势菌门从冷藏前期（0、2 d）的拟杆菌门、厚壁菌门逐渐转变为中（4 d）、后期（6、8 d）的变形菌门；
属水平分析表明，细菌优势菌属从冷藏前期的拟杆菌属、逐渐转变为中、后期的假单胞菌属、气单胞菌属、、沙雷氏菌属。2）PCoA显示0-2、4、6、8 d之间微生物结构差异较大，两个PC叠加解释度达80.92%；
LEfSe分析表明，引起大鲵肉各冷藏期差异显著的菌门主要为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、纤维杆菌门、厚壁菌门，菌属主要为假黄单胞菌属、、沙雷氏菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、ambiguous_taxa、、Rikenellaceae_RC9_gut_group、_9、拟杆菌属、纤维杆菌属、毛螺菌属、、_1。3）进化分析表明大鲵肉冷藏过程中微生物菌群的演替与冷藏时间具有较强相关性。综合分析，引起冷藏过程中托盘包装大鲵肉腐败变质的微生物可能为假单胞菌属、气单胞菌属、和沙雷氏菌属。该研究为今后大鲵肉冷藏过程中靶向抑菌保鲜及货架期延长提供参考。