四溴乙基环己烷对绿豆种子萌发和幼苗生长的影响

时晓丽,杨 洋,张会茹,罗爱国

(晋中学院生物科学与技术系，山西晋中 030619)

四溴乙基环己烷(tetrabromoethylcyclohexane)，又名1,2-二溴-4-(1,2-二溴乙基)环己烷(TBECH或DBE-DBCH)，是一种被广泛用于泡沫塑料、黏合剂、塑料制品和电力电缆涂料等材料的新型溴代阻燃剂(NBFRs)。TBECH被认为是传统溴代阻燃剂多溴联苯醚(PBDEs)和六溴环十二烷(HBCDs)的潜在替代品。研究表明，TBECH具有潜在的环境持久性和长距离迁移性，其较高的亲脂性(log=5.24)意味着TBECH具有潜在的生物富集性和放大性。TBECH已被美国环保署列入环境关注的化合物。

截至目前，TBECH在环境介质、生物体内、甚至非职业暴露人群的血清中被检出。TBECH的生物毒性效应受到广泛关注。体外试验和对鱼类、鸟类等体内试验研究表明，TBECH具有内分泌干扰毒性、神经毒性、免疫毒性和肾毒性。此外，TBECH具有多模式内分泌干扰作用，包括雌激素、抗雄激素和甲状腺激素等毒性作用。目前关于TBECH的毒性效应多集中在水生生物和动物体内。但是，关于新型溴代阻燃剂TBECH对植物毒性的影响才开始受到关注。

土壤是溴代阻燃剂重要的汇，溴代阻燃剂进入土壤后迅速与土壤有机质结合。因此，溴代阻燃剂的生物富集与土壤有机质的含量和性质有关。植物是陆地生态系统的基本生命组成部分，能够吸收、富集和代谢一定浓度的有机污染物，如杀虫剂、双酚类似物和阻燃剂等。有机污染物可以通过植物吸收进入食物链，从而对野生动物和人类健康造成风险。为了更好地了解植物对有机污染物的生化和分子反应，有必要检测有机污染物的植物毒性。目前，关于传统溴代阻燃剂(如PBDEs)的植物毒性效应已经有了较为深入的研究。PBDEs能够诱导植物细胞产生过量活性氧(ROS)，引起玉米根细胞膜脂过氧化、蛋白羰基化和DNA双链断裂等损伤，影响植物组织和细胞的正常代谢过程，最终导致植物生长受到抑制甚至死亡。西葫芦和萝卜通过自身吸收转运PBDEs到地上部分来减少其在环境中的含量，提高土壤中PBDEs的生物有效性，进而增加人类暴露风险。

绿豆(L.)属于豆科草本植物，富含多种营养物质，且具有强的固氮能力，可以有效改善土壤肥力，是我国的主要粮食作物之一。该研究采用绿豆为受试植物，探究TBECH对绿豆种子萌发和幼苗生长的影响，通过测定种子发芽率、发芽势、干重、鲜重以及幼苗株高、根长、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性来初步研究TBECH对绿豆的毒性效应，为评价TBECH对绿豆的毒性作用提供科学依据。

供试绿豆为大同小明绿豆种子(购自中国农业科学研究院)。TBECH(纯度>95%)购自上海艾美克生化有限公司。其他试剂购自北京化学试剂公司，均为分析纯。

配制不同浓度(0、60、120、180 μg/L)的TBECH溶液备用。选择大小相近饱满的绿豆为供试植物。3% HO对绿豆种子处理30 min，用蒸馏水进行反复冲洗。

种子暴露：在铺有2层滤纸的培养皿中各放置10粒绿豆种子，并加入25 mL不同浓度暴露液。对照组用等量的去离子水培养，每个处理设置3个平行。将种子置于25 ℃相对空气湿度80%的恒温培养箱中进行避光培养。幼苗暴露：发芽4 d后，将长势均一的绿豆幼苗转移至锥形瓶进行暴露，每瓶放置10颗幼苗，每个处理设置3个平行。置于25 ℃恒温培养箱中培养，白天光照14 h，暗培养10 h。每天更换暴露溶液以消除浓度改变的影响。在每个暴露瓶外部用铝箔包裹以防TBECH发生光解。

从绿豆暴露第2天起，每天记录露白数、发芽数、根长至种子体长1/2数。分别在第3天和第6天，计算每个处理种子的发芽势和发芽率。

发芽率=第6天供试绿豆种子发芽数/总种子数×100%

发芽势=第3天供试绿豆种子发芽数/总种子数×100%

鲜重的测定。发芽试验结束后，定性滤纸吸干水分，用电子天平称量15粒绿豆种子的总鲜重。每个浓度各取3个平行组种子鲜重的平均值。

干重的测定。发芽试验结束后，分别从各组中随机选取5粒绿豆种子，放入电热恒温鼓风干燥箱中于105 ℃下烘15 min后调至80 ℃烘干至绿豆种子恒重，用电子天平称其干重。每个浓度各取3个平行组干重的平均值。

选取生长状况良好、长势相似的9株幼苗，连续5 d进行根长、株高的测量。将绿豆植株水平放置，直接用尺子测量株高。由于根部弯曲脆弱故采用细线测量，做好标记后用尺子测量标记长度，观察在不同浓度下绿豆生长状况的变化。

用无菌水清洗绿豆幼苗，拭去水分，称取幼苗鲜样0.3 g置于玻璃研磨器中，在冰浴中加少量石英砂，用5 mL KHPO将幼苗研磨成匀浆，转入离心管，4 ℃ 4 000 r/min离心15 min，取上清液，即得到样品粗酶液。

采用Bradford法，以牛血清蛋白为标准测定幼苗中的蛋白含量。采用愈创木酚法测定POD的活性，在470 nm波长下测定其吸光度，根据吸光度计算POD活性。采用紫外吸收法测定CAT活性，在波长240 nm下测定其吸光度，根据吸光度计算CAT活性。

利用GraphPad Prism 5进行统计学分析。数据分析采用多组独立样本(≥3)单因素方差分析，<0.05表示数据具有统计学意义。

暴露于不同浓度TBECH(0、60、120、180 μg/L)溶液中绿豆种子的发芽率、发芽势、鲜重和干重见图1。从图1可以看出，随着TBECH浓度的增加，TBECH对种子发芽率和发芽势的影响无显著差异。与对照组相比，绿豆种子的鲜重和干重随着TBECH浓度的增加而显著下降。在60～180 μg/L，鲜重从3.37 g下降到2.91 g，干重从100.08 mg下降到75.67 mg。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)图1 不同浓度TBECH对绿豆种子发芽率、发芽势、鲜重和干重的影响Fig.1 Effects of different concentrations of TBECH on germination rate, germination potential,fresh weight and dry weight of Vigna radiata seeds

从图2可以看出，TBECH对绿豆幼苗茎的伸长有显著的抑制作用且具有浓度依赖性(<0.05)。与对照组相比，当TBECH浓度为180 μg/L时，株高由5.4 cm降低至3.4 cm，仅为对照组的63.0%。TBECH处理5 d后，根系生长形态出现显著变化。随着暴露浓度的增加，主根和侧根变短，侧根数量减少，且主根出现断裂的情况。TBECH浓度达到180 μg/L时，主根的根长由4.9 cm 降低至0.9 cm,是对照组的18.4%(<0.05)。TBECH对幼苗主根生长的抑制作用高于对茎的抑制，可能是由于根部富集的有机污染物浓度较高的原因。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)图2 不同浓度TBECH对绿豆幼苗株高和根长的影响Fig.2 Effects of different concentrations of TBECH on plant height and root length of Vigna radiata seedlings

不同浓度TBECH溶液处理绿豆幼苗5 d后，测定绿豆幼苗中2种抗氧化酶POD和CAT的活性变化(图3)。从图3可以看出，随着暴露浓度的增加，POD的活性呈上升趋势；
当暴露浓度为60、120、180 μg/L时，处理组幼苗POD的活性显著升高，分别是对照组的1.3、2.0和2.1倍(<0.05)。CAT的活性随着TBECH暴露浓度的增加而显著升高；
浓度为180 μg/L时，CAT的活性达到最大值，是对照组的3.2倍。该研究结果表明在最高浓度的TBECH处理下，POD和CAT活性显著增加，表明TBECH能够诱导绿豆幼苗发生氧化损伤，导致绿豆幼苗生长延迟。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)图3 不同浓度TBECH对绿豆幼苗抗氧化酶POD和CAT活性的影响Fig.3 Effects of different concentrations of TBECH on the activities of antioxidant enzymes POD and CAT in Vigna radiata seedlings

种子萌发期间的生长状况直接影响着植物的生长发育和产量。目前，已有多种苗期生长指标用于研究多溴联苯醚、六溴环十二烷等有机污染物的生态毒理学效应。该研究选用绿豆作为受试植物，研究不同浓度TBECH对绿豆种子萌发和幼苗生长的影响。将绿豆种子和幼苗暴露于0～180 μg/L TBECH中，发现TBECH能够抑制绿豆种子的萌发和幼苗生长；
TBECH能够显著降低种子的鲜重和干重等生物量，但对种子发芽率和发芽势的影响无显著差异。Xu等研究发现多溴联苯醚BDE-47、6-OH-BDE-47和6-MeO-BDE-47均能够抑制玉米种子的萌发，暴露浓度为5 μg/L 时，玉米种子的发芽率分别为76.2%、73.6%和66.3%，与该研究的结果不一致。王练书研究发现100 mg/kg高溴代阻燃剂BDE-209能够降低玉米的发芽率，与该研究的结果一致。据报道，PBDEs通过影响植物的结构和功能，破坏色素体膜系统、类囊体、线粒体结构，进而抑制植物的生长发育。绿豆种子生物量的显著下降表明，TBECH可能通过种皮渗透进入植物细胞，影响细胞质膜的组分、透性和运输等，进而损害膜的正常生理功能，破坏细胞的代谢作用。张琼等研究发现3 mg/L 4,4′-二溴联苯醚(BDE-15)能够显著降低纤细裸藻的蛋白含量，抑制率达69.70%。为了抵御TBECH的侵害，种子呼吸作用增强，从而进一步影响绿豆的代谢作用。

该研究发现TBECH对绿豆幼苗茎的伸长有显著的抑制作用且具有浓度依赖性。当TBECH浓度为180 μg/L 时，株高仅为对照组的63.0%。随着暴露浓度的增加，主根和侧根变短，侧根数量减少，且主根出现断裂的情况。TBECH对幼苗主根生长的抑制作用高于对茎的抑制，可能是根部富集的有机污染物浓度较高的原因。Wu等研究发现六溴环十二烷(HBCD)能够抑制玉米的生长，HBCD对根的抑制率(31.94%)显著高于对茎叶的抑制率(11.97%)。玉米地上部分对β-HBCD的总富集量低于根部，主要通过根部吸收和茎向传输2种方式进行积累。谢显传研究发现100 mg/kg十溴联苯醚(BDE-209)对黑麦草株高和根长的抑制率均为25%。李丽华等研究发现1 000 mg/kg BDE-209使紫花苜蓿的根长减小20.7%，芽长减小18.3%。赵良元研究发现30 mg/kg BDE-209对水葱产生毒性作用，使水葱的株高和茎粗分别降低34.4%和28.1%。以上发现均与该研究的结果一致。植物的根是污染物与植物的第一个接触点，污染物对植物根系生长的抑制作用会影响营养物质在植物内的吸收和运输，进而影响茎的伸长。

在污染物胁迫下，植物各组织细胞产生的活性氧增加，这是植物中毒的普遍表现。如果不及时清除，会导致脂质过氧化、DNA损伤和酶活性丧失等效应。植物具有由POD和CAT组成的抗氧化防御系统，在清除氧化胁迫产生的活性氧方面发挥重要作用。植物中毒症状较轻时，植物通过增大抗氧化酶活性来清除活性氧。随着中毒症状的加重，植物的生命力快速下降，抗氧化应激能力随之减弱直至消失，抗氧化酶活性出现低促高抑的现象。在植物体清除ROS过程中POD和CAT起关键作用，POD和CAT催化HO发生歧化反应生成HO和O。随着污染物暴露浓度的增加，HO水平逐渐升高，最终超过抗氧化酶的清除能力，导致氧化损伤的发生。抗氧化酶表达水平的改变被认为是ROS产物触发氧化应激的指示物。该研究结果发现幼苗抗氧化酶POD和CAT的活性随TBECH浓度的增加而显著提高，最高浓度180 μg/L TBECH的暴露诱导POD和CAT活性显著增加，分别是对照组的2.1和3.2倍，表明TBECH的胁迫诱导绿豆幼苗发生氧化应激，从而导致绿豆幼苗生长延迟。绿豆为了阻止超氧化物自由基和羟基自由基的形成，激活了绿豆体内的抗氧化酶活性，进而保护细胞膜系统免受损害。孟范平等研究发现低浓度2，2′，4，4′-四溴联苯醚(BDE-47)(0.1和1.0 μg/L)处理海水小球藻24 h能够诱导其SOD和CAT酶活性增加，随着暴露时间的延长这2种酶的活性受到抑制。BDE-209处理杂交狼尾草，其CAT酶活性也呈现先上升后下降的趋势。武彤等研究发现β-HBCD能够诱发玉米体内抗氧化酶系统的应激反应，SOD和APX(抗坏血酸过氧化物酶)活性出现先增加后降低的趋势，与该研究的结果不一致。王丹研究发现TBECH能够诱导玉米体内活性氧累积量增多和抗氧化酶CAT、SOD和POD基因表达上调，与该研究的结果一致。

综上所述，TBECH对绿豆具有毒性作用，在绿豆种子中，TBECH能够显著降低种子的鲜重和干重等生物量，但对种子发芽率和发芽势的影响无显著差异。在绿豆幼苗中，TBECH对绿豆幼苗茎根的伸长有显著的抑制作用且具有浓度依赖性，TBECH对幼苗主根生长的抑制作用高于对茎的抑制。幼苗抗氧化酶POD和CAT的活性随TBECH浓度的增加而显著提高。氧化应激可能是导致植物毒性的关键因素。该研究为更全面地了解TBECH的环境行为和毒性效应提供了有价值的信息。为了阐明TBECH对绿豆的致毒机制，今后有必要使用组学技术结合分子生物学手段进行进一步研究。