时间分辨荧光免疫层析法测定粮食中的黄曲霉毒素B1

张少波 邓常继 张海涛 朱启思

摘要：采用时间分辨荧光免疫层析试纸条及配套的荧光定量分析仪，对粮食中黄曲霉毒素B₁的快速检测进行了研究。结果表明，该方法的检出限为0.8 μg/kg，定量限为2.6 μg/kg，不同水平的加标回收率在94%～108%。选取标准质控样品进行测试，液相色谱法检测结果与该方法结果基本一致。该方法准确可靠，操作简便，适用于粮食中黄曲霉毒素B₁的快速检测。

关键词：时间分辨荧光免疫层析法;黄曲霉毒素B₁;粮食

中图分类号：TS210.7文献标识码：ADOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210618

我国粮食产量连续7年保持在6.5亿t以上，实现粮食生产十八年连续丰收[1]。在粮食数量安全得到保障的前提下，粮食质量安全越来越受到重视，消费者对安全、健康、营养粮食产品的诉求益加强烈。近年来，受天气等环境影响，真菌毒素成为威胁我国粮食质量安全的主要因素。据不完全统计[2]，我国每年因真菌毒素污染造成的粮食损失累计超过3 000 万t。

真菌毒素是真菌在生长过程中产生的次级代谢产物[3]。致癌性是真菌毒素的主要危害，其中以黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁，AFB₁）致癌性最强，被国际癌症研究所列为I级致癌物[4]。鉴于AFB₁的剧毒性和普遍性，早在2002年，国家质检总局规定小麦粉、玉米、食用油、酱油、醋5类食品实行“市场准入制度”，必须检验AFB₁的含量[5]。近年，相关部门多次修订真菌毒素限量标准，严格监管。

AFB₁的检测方法主要有免疫亲和层析液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫法、胶体金法等。免疫亲和层析液相色谱法是测定真菌毒素使用最为普遍的方法之一，但其操作周期较长，需要用到的有机试剂较多、耗材较贵;液相色谱-质谱联用法所需设备更为昂贵，酶联免疫法和胶体金法易受基质干扰，容易出现假阳性或假阴性[6]。时间分辨荧光免疫层析法是近年发展较快的一种检测技术，具有灵敏度高、检测速度快、结果稳定等优点，已在食品检测行业得到应用[7]。本文拟对该方法在稻谷、玉米等粮食样品检测中的应用进行研究，以期为其进一步推广使用提供依据。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

SW-2型时间分辨荧光免疫层析定量检测仪、AFB1时间分辨荧光免疫层析定量检测卡：江苏省苏微微生物研究有限公司;AL204-IC型电子天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司;3310型盘式实验粉碎磨：波通瑞华科学仪器有限公司;Multi Reax型旋涡混匀器：德国Heidolph公司;MINI-7K型微型离心机：杭州米欧仪器有限公司;Milli-Q型超纯水仪：美国密理博公司;20 ～ 200μL和100 ～ 1 000μL单道可调移液器：德国Eppendorf 公司。

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：德国Merck公司;AFB₁免疫亲和柱、样品稀释液：江苏省苏微微生物有限公司;玉米全粉中黄曲霉毒素B₁成分分析标准物质[GBW（E）100386]、花生油中黄曲霉毒素B₁成分分析標准物质[GBW（E）100604]、糙米粉中黄曲霉毒素B₁成分分析标准物质[GBW （E）100607]及黄曲霉毒素B₁标准品[GBW（E）100302]：国家粮食和物资储备局科学研究院。

1.2试验方法

1.2.1样品前处理

准确称取2.00 g粉碎样品（稻谷样品需垄谷）于50 mL离心管中，加入20 mL 70%甲醇水至离心管中，涡旋提取2 min，高速离心5 min，取上清液。

1.2.2样品检测

测试前，将未开封的检测卡及试剂平衡至25 ℃。将检测卡平放，用移液器定量吸取100μL上清液加入900μL样本稀释液中，反复吸打5次以充分混匀，后再吸出100μL此混合液垂直滴加于加样孔中，室温下反应10 min后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫层析检测仪中检测;在仪器感应区中放置对应的标准曲线智能卡，在主界面的“测量”菜单中点击读取智能卡后，点击“样品测量”进行检测仪器读数完成后会自动计算出被检样本中的AFB₁含量，可选择储存及打印结果。

1.2.3检测方法的评价

（1）定量曲线：将AFB₁的标准品，用50% 甲醇水定容配制成1 000 ng/mL的标准储备溶液;采用0.4% 的吐温-PBS（pH 7.2，0.01 moL/L）稀释成0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 ng/mL的标准工作溶液。分别取100 μL加至层析卡的样品孔中，每个浓度设置3个平行，由低浓度到高浓度进行检测，时间分辨荧光仪检测T 线荧光强度与C线荧光强度，计算T/C值。

（3）准确度：按照1.2.1的前处理方法，在阴性稻谷样品中分别加入10、20、60μg/kg的AFB₁标准溶液，测定方法的加标回收率。

式中：P为加标回收率，%;c₁为阴性稻谷测定值，μg/kg;c₂为加标稻谷测定值，μg/kg;c₃为加标量，μg/kg。

（4）精密度：分别选择低、中、高3种浓度的AFB₁标准工作溶液，采用不同批次的测试卡，10次重复试验，计算批间和批内变异系数（CV）。

式中：CV为变异系数，%;SD为标准偏差，ng/mL;MN为平均值，ng/mL。

（5）与国标仲裁法的对比试验：取不同基质不同浓度的AFB1标准物质，先用国标仲裁法——免疫亲和层析液相色谱法测定，再使用时间分辨

荧光免疫层析法测定，进行对比验证。

2结果与讨论

2.1定量曲线

对系列标准工作溶液进行测试，以标准工作溶液浓度的自然对数值（InC）为横坐标，各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T₀/C₀值的比值所得百分比为纵坐标，得到一条平滑的S曲线，如图1所示。

由图1可以发现，在0.01 ～ 1.0 ng/mL浓度范围内，存在一段接近于直线的曲线，其线性方程为y = -15.704x + 23.702，相关系数R²= 0.994 8。由此，选定AFB₁标准曲线的线性范围为0.01 ～ 1.0 ng/mL，并以AFB₁浓度为横坐标，对应的T/C值为纵坐标，建立定量曲线，结果如图2所示。

2.2检出限和定量限

由表1可知，本方法的检出限和定量限分别为0.8、2.6 μg/kg，优于GB 5009.22—2016第四法酶联免疫吸附筛查法（方法检出限为1 μg/kg，定量限为3 μg/kg）和LS/T 6111—2015胶体金定量检测法（方法检测限为2 μg/kg），满足GB 2761—2017规定的粮食样品AFB₁的限量要求。

2.3准确度

对阴性稻谷样品进行3水平6平行加标回收率试验，结果如表2所示。由表2可知，本方法加标回收率在94% ～ 108%，相对标准偏差在10%以内，满足检验的要求。

2.4精密度

分别选择0.025、0.1、1 ng/mL 3种浓度的AFB1标准工作溶液，按照1.2.2的检测方法，采用不同批次的测试卡重复试验10次，结果见表3。由表3可知，批内CV值在7.44%～9.43%，小于10%;批间CV值在11.90% ～ 14.65%，小于15%，说明该方法均一性良好。

2.5与国标仲裁法的对比试验

分别采用液相色谱法和时间分辨荧光免疫层析法检测玉米全粉中黄曲霉毒素B₁成分分析标准物质、糙米粉中黄曲霉毒素B₁成分分析标准物质、花生油中黄曲霉毒素B₁成分分析标准物质，结果如表4所示。由表4可知，在不同的粮食基质中，时间分辨荧光免疫层析法检测值与液相色谱法检测值较为一致，均在所测标准物质的标准值内。

3结论

本文对时间分辨荧光免疫层析法在粮食样品的黄曲霉毒素B₁检测进行了研究。该方法的检出限为0.8 μg/kg，定量限为2.6 μg/kg，线性范围为0.1 ～ 1 ng/mL，不同水平的加标回收率在94%～108%，批内与批间变异系数（CV）分别在7.44% ～ 9.43%、11.90% ～ 14.65%，均小于15%。选取不同基质的标准质控样品进行测试，本方法与液相色谱法检测结果基本一致，在所测标准质控样品的标准值范围内。上述结果说明，本方法的准确度和精密度满足使用要求，且具有简便、快速、经济等特点，适用于玉米、稻谷等粮食的黄曲霉毒素B₁快速检测。参考文献

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Detection of AFB1 in Grain by the Time-resolved Fluoro-immunoassay

Zhang Shaobo1，Deng Changji2，Zhang Haitao3，Zhu Qisi1

（1. Guangdong Provincial Food and Strategic Reserves Assurance Center，Guangzhou，Guangdong 510050;

2. Guangdong Institute for Cereal Science Research，Guangzhou，Guangdong 510050;3. Jiangsu SUWEI Microbiology Research Co.，LTD，Wuxi，Jiangsu 214000）

Abstract：This research used time-resolved fluoro-immunoassay strip and assorted time-resolved fluoro-immunoassay portable quick tester to detect aflatoxin B₁in grain. The assay showed that the limit of determination and the limit of quantification were 0.8 and 2.6 μg/kg，respectively. The recoveries of samples at different levels were rang between 94% to 108%. The results of the standard quality control sample had a good agreement with those of HPLC. This method was accurate，sensitive and convenient. It is suitable for the rapid screening of AFB₁in grain samples.

Key words：time-resolved fluoro-immunoassay，aflatoxin B₁，grain