裸鼠皮下埋雌激素_不同剂量雌激素对裸鼠血管瘤模型的影响

　　[摘要]目的:建立人毛细血管瘤裸鼠移植模型,探讨血管瘤裸鼠模型建立的最佳条件。方法:将手术切除的1例雌激素受体阳性的儿童增生期血管瘤组织制成组织块,植入20只裸鼠(BALB/ c nude mice) 皮下,每只4 处,将20只裸鼠分为4个实验组。实验1组在移植后给予普通鼠食喂养;实验2 组在1组基础上每周肌注雌二醇0.01 mg;实验3组在1组基础上每周肌注雌二醇0.1mg;实验4组在1组基础上每周肌注雌二醇1mg,于移植后第30、60、90天切取移植瘤。移植瘤标本进行病理学光镜检查,用血管内皮细胞单克隆抗体CD31、CD34进行免疫组化染色。 结果:移植后早期各组标本内皮细胞大量变性、坏死,30天后,单纯喂养的实验1组及实验2组部分移植瘤开始吸收或形成脓肿及纤维化。实验3、4组移植瘤开始缓慢生长。90天后实验1组、实验2组移植瘤均未成活,实验4组移植瘤部分成活,而实验3组移植瘤全部成活。光镜下成活的移植瘤与原血管瘤组织生物学特点相似。 结论:不同剂量的雌激素对血管瘤裸鼠移植模型的建立有一定影响,适量的应用雌激素可建立稳定的人血管瘤裸鼠移植动物模型。该模型可以应用到基础和临床的血管瘤研究。
　　[关键词]血管瘤;动物模型;裸鼠;雌激素
　　[中图分类号]R732.2 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)02-0200-04
　　
　　The effects of different estradiol dose on hemangioma model in nude mouse
　　MA Ge-jia1,YI Cheng-gang1, SUN Zhi-yong2,PEI Jiao-miao1,WANG Shi-ping1,XIA Wei1,GUO Shu-zhong1,YANG Li1
　　(1.Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi"an 710032, Shaanxi, China; 2. Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning, 530021, Guangxi, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveThe aim of this study was to establish the human hemangioma model in nude mice and investigate the best conditions for it. Methods Our specimen of the grafted strawberry hemangioma in proliferative phase was taken from a child patient by surgery, and made it into small pieces, then inoculated subcutaneously into 20 BALB/ c nude mice that were randomly divided into 4 groups, namely, group I (n=5) with normal diet, groupⅡ(n=5) with normal diet and 0.01mg estradiol administered intramuscularly every week additionally, groupⅢ(n=5) with normal diet and 0.1mg estradiol administered intramuscularly every week additionally, groupⅣ(n=5) with normal diet and 1mg estradiol administered intramuscularly every week additionally. The hemangioma tissues were harvested on the 30th, 60th and 90th days after graft and then subjected to histopathological examination and immunohistochemistry staining for CD31, CD34. Results In the early periods after graft, the endothelial cells of the specimens were degenerated and there were necrosis in all groups. The hemangioma tissues in groupⅠ andⅡ became absorbed or abscessed or fibrosis, however, the tissues in group Ⅲ and Ⅳ grew slowly in the first 30 days. The samples of hemangioma in groupⅠ and Ⅱwere disappeared completely, and survived partially in groupⅣ with a completely survival in groupⅢ after 90 days. The section of survived grafted hemangioma had similar biological characteristics with the original tissue under the light microscope.Conclusion The effects of different estradiol dose on hemangioma model in nude mouse were represent as quantum libet estradiol application could establish a stationary animal model of human hemangioma which have the potential to be used in foundation and clinical study on hemangioma.
　　Key words:hemangioma;animal model;nude mouse;estradiol
　　
　　血管瘤(hemangioma) 是婴幼儿最常见的良性肿瘤,通常发病率约为0.3%～ 1%,好发于头面颈部、四肢等体表部位[1]。Mulliken 和Glowacki[2]根据病史、瘤体生长情况及内皮细胞等特征将其分为血管瘤和血管畸形(vascular malformation),并且根据内皮细胞生长、肥大细胞计数以及纤维细胞形成等将血管瘤分为增殖期(proliferating phase)、消退期(involuting phase)、消退后期( involuted phase) 3个阶段,其中相当一部分血管瘤可以自然消退。但其消退的机制尚不清楚,临床难以预先判断其是否能够消退及其危害性。由于对血管瘤生物学特性认识不清,尚难以发现其规律,因此对血管瘤的研究一直是热点。为探求其生物学特性,有人设计了用裸鼠作载体,移植人体血管瘤,建立动物模型[3]。但是如何寻找其最佳的模型建立条件,是我们所要探求的。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1人体血管瘤标本来源:瘤体组织标本来源于我科1 例近期瘤体生长迅速的5个月女性患儿手腕部的增生期血管瘤。病理学检查光镜下见肿瘤组织位于真皮层内,无明显包膜,由大小不等的变形毛细血管内皮细胞及其形成的管腔构成,腔内可见红细胞,局部有的内皮细胞成团,尚无管腔形成。
　　1.2实验动物分组及饲养:裸鼠(BALB/c nude mice) 20 只,雌雄不限,鼠龄20～24天,体重18～21g,随机分成4组,每组5 只,一组为单纯接种组,剩下3组为雌激素作用组。实验1组在移植后给予普通鼠食喂养;实验2组在1组基础上每周肌肉内注射雌二醇(SIGMA,美国)1次,每次0.01 mg,共12次;实验3组在1组基础上每周肌肉内注射雌二醇1次,每次0.1 mg,共12次;实验4组在1组基础上每周肌肉内注射雌二醇1次,每次1mg,共12次。每只动物均独笼饲养,普通鼠食喂养。裸鼠由第四军医大学实验动物中心提供及饲养。
　　1.3动物模型的建立:在无菌条件下手术切除患儿血管瘤组织,切成4mm×3mm×3mm 的小块,用PBS液漂洗3次,分别经皮肤切口置入所有实验裸鼠颈部两侧及左侧臀部皮下和右侧腹股沟处,每只4 处。移植工作在标本离体后1h内完成。
　　1.4肿瘤的生长观察及测量:每周定期观察裸鼠及移植瘤生长情况。于接种后15天、30天、60天、90天分别用游标卡尺测量肿瘤最大直径a 及横径b,根据公式V =π/6×a×b2粗略估算肿瘤体积变化。
　　1.5病理组织学观察及免疫组化检测:各组实验鼠均于移植后第30、60、90天切取移植瘤。HE染色,光镜观察。以裸鼠肌肉组织切片的CD31、CD34标记为阴性对照,行移植瘤切片免疫组化的阳性细胞计数,计算每个瘤组织CD31、CD34的阳性指数。每张切片在400倍光学显微镜下随机选取10个视野,每个视野统计100个细胞中的阳性细胞数,其总数除以10,再乘100%,即为其阳性指数。CD31、CD34由西安壮志生物技术有限公司提供(abcam,英国)。
　　1.6统计学处理:实验数据用SPSS12.0(SPSS Inc. Chicago, Illinois)统计软件处理,采用方差分析,P�0.05,有显著性差异。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 裸鼠及移植瘤的生长特点:饲养90天,所有裸鼠均存活。实验1组(单纯瘤体移植组)1个月后所有移植瘤组织体积都不同程度地变小,到90天时有9处完全吸收消失,其余11处均不同程度地变小、硬化、消退。实验2组(低剂量0.01mg组)植入后瘤体也有不同程度的变小,90天后也有部分变小、消退。实验3组(0.1mg组)与实验4组(1mg组)1个月后都有增大,但是实验4组有部分瘤体增长速度过快而发生溃破,最终纤维化,消失。实验3组瘤体稳定的逐渐变大。(表1,图1)
　　2.2 光镜下瘤体病理学检查:移植后30天,实验1组已可见少量纤维组织和吞噬细胞,部分纤维组织分隔瘤组织成小叶状,可见间质细胞。其余三组可见含有较多单层细胞的毛细血管腔。移植60天后,实验1组已无明显的血管腔样结构,多被纤维结缔组织和脂肪组织替代;实验2组也可见纤维结缔组织和脂肪组织。其余两组可见增生活跃的内皮细胞,细胞体积不规则,形成较多含单层内皮细胞的毛细血管腔和血窦。但实验4组,既1mg组,部分瘤体增殖过快,发生溃破;其余瘤体内皮细胞增殖活跃,有血窦样结构生成,内含大量红细胞。移植90天后,实验1、2组大部分瘤体消失,剩余全部纤维化。实验3组细胞间质和血管内皮细胞都增多,毛细血管管腔密集,有大量血窦生成,内可见红细胞(图2)。实验4组部分溃疡后遗留纤维结缔组织,其余瘤体情况同实验3组。
　　2.3移植瘤免疫组化检测
　　2.3.1CD31在30天时,在各组都有阳性表达。60天时,实验1组与2组表达率下降,实验3组与4组表达率升高。90天时,实验1组无瘤组织,实验2组残留组织几乎没有表达;实验3组阳性细胞表达依然很高,实验4组剩余瘤组织阳性细胞表达同样较高。作为对照的裸鼠肌肉组织CD31表达为阴性。(表2,图3)
　　2.3.230天时CD34在各组都有明显的表达。60天后实验1组和2组表达阳性细胞数明显下降,实验3组和实验4组中正常瘤组织阳性细胞数表达升高。90天时实验1组已无瘤组织,实验2组剩余瘤组织表达很低;实验3组仍然呈强阳性表达,实验4组剩余瘤组织也有较强表达。(表3,图4)
　　
　　3讨论
　　
　　 人们很早就观察到皮肤血管瘤的生长与雌激素水平有关,近期研究发现增殖期血管瘤中雌激素和雌激素受体(ER)都比消退期要高很多[4-5]。Sasaki 等[6]发现,婴幼儿增殖期血管瘤患儿血浆雌二醇水平较正常同龄儿高出4倍,且瘤组织中ER 显著高于正常皮肤血管组织。Khalid等[7]用免疫组化法证实增生的毛细血管瘤内皮细胞和肿瘤血管组织中雌激素受体相关抗原ER-D5表达增高。此后,一些学者就血管瘤中ER的表达做了免疫组化研究。目前认为,血管瘤是雌激素的靶组织之一,雌激素和ER在血管瘤的发生发展中可能产生某种重要作用[8-9]。大量的体内外实验发现,雌激素与一些肿瘤的血管生成密切相关,并且其促血管生成作用主要通过上调VEGF、bFGF 的表达,使两者协同来实现[10]。如乳癌、子宫内膜异位症中,雌激素能通过上调VEGF 基因的表达增强其血管生成作用[11-14]。Hyder等[15]发现,VEGF基因上有2个核苷酸序列与ER 基因中的雌激素反应元件高度同源,分别位于VEGF基因的5"和3"非翻译区,这2个序列可与ER 特异地结合,雌激素即可与ER结合影响VEGF的表达。雌激素作为一种促有丝分裂原,能与胞核内的ER结合,发生构象改变,作用于转录辅助因子,导致特异性基因转录水平的变化,促进细胞DNA、RNA 和蛋白质合成,刺激细胞分裂增殖[16-17]。但雌激素在血管瘤生长机制中所起的作用一直不明,有的学者认为雌二醇在有细胞生长因子(如血管内皮因子,或纤维细胞生长因子)共同存在的条件下,对血管内皮细胞繁殖有促进作用[18],但作用机制尚不明确。
　　目前对血管瘤的研究,大部分是建立在对离体人血管瘤标本的研究基础上。近年来,随着实验动物学的发展,逐步建立起各种血管瘤的实验动物模型。有的是利用动物身体上某一特殊部位与毛细血管形态和结构的相似性来进行研究。应用最多的是利用鸡的鸡冠和肉垂。有的是利用实验动物的肝、脾组织存在大量血窦和内皮细胞的特点,作为海绵状血管瘤的动物模型。有学者[19]应用DNA显微注射法,将 Py-MT基因导入小鼠受精卵,并植入母鼠输卵管。结果在62只新生小鼠中得到1只具有血管瘤样表型的小鼠。该小鼠的唇、舌、掌心、皮肤及胃黏膜表面均可见有血管样异常增生物。增生物经组织学检查为一些有扁平细胞衬里的充满血的海绵状囊腔结构,类似于海绵状血管瘤的组织学表现。还有利用细胞悬液接种的办法制作血管瘤裸鼠模型[20]等。研究表明,雌激素可使实验动物的血管床明显充血,促进移植物毛细血管及营养血管的形成。体内高水平的雌激素可能通过相应受体刺激内皮细胞的增殖和血管的充血,来影响血管内皮细胞的生长[21]。同时,雌激素也可以直接作用于血管,使微血管扩张,血管床容量增加,从而促进移植瘤的成活。
　　研究人血管瘤的机制和防治方法,我们需要所用模型中血管瘤生长特点与人体血管瘤的自然生长过程相似,肿瘤表达稳定移植瘤在动物体内可持续繁殖和存活,移植瘤的形态、功能与原人体肿瘤保持一致及移植瘤来源于人体而非动物自身的诱发瘤。研究发现血管瘤内皮细胞可表达多种特异性的内皮标志,如 CD31、CD34、VWF等[22-23]。其中CD31、CD34是微小血管内皮细胞的特异性标志物,在毛细血管瘤内皮细胞中为高表达。我们用鼠抗人的CD31、CD34单克隆抗体检测移植后血管瘤组织,结果增殖的移植瘤中呈强阳性表达(检测移植前的原供体血管瘤组织,也呈强阳性表达),而消退的组织中表达明显下降,而在作为阴性对照的裸鼠肌肉组织表达为阴性,证明其内皮细胞来源是人而不是裸鼠。
　　我们在彭强等[3]人血管瘤动物模型的建立方法的基础上,探寻最佳的雌激素用量,探讨血管瘤裸鼠模型建立的最佳条件。试验中使用雌激素后我们发现相对于未使用雌激素的移植物增殖迅速,但是移植物的增殖对于雌激素的剂量还是存在依赖性,不使用或使用雌激素剂量过低不能够有效的维持移植物的增殖;早期各组移植物内皮细胞都有坏死和凋亡的情况, 30天后,无雌激素和低剂量雌激素组可以观察到移植物中有大量的纤维结缔组织增生,血管内皮和血管管腔样结构消失,血管闭塞,同时还有大量的巨噬细胞浸润,免疫组化检测发现CD31、CD34阳性表达的细胞数量明显减少。其它两组内皮细胞在坏死和凋亡后又迅速的增殖,出现大量无规则的紊乱的内皮细胞和管腔样结构,还可见有血窦样结构,内充斥有红细胞;CD31、CD34免疫组化检测发现表达阳性的细胞大量增生,有成团聚集的倾向。但同时我们也发现如果雌激素用量过大,会出现部分瘤体生长迅速并发生溃破、坏死;在1mg组(既实验4组)观察到坏死的移植物溃破到表皮形成溃疡样的结构。我们认为是由于过量雌激素刺激使移植物增殖过快,而血供难以跟上而发生移植物的坏死。在制作模型过程中适当的应用雌激素,可以维持并且促进移植物的生长,血管内皮细胞和血管管腔样结构也增多,有血窦样结构生成,内可见有红细胞聚集;免疫组织化学检测显示CD31、CD34阳性表达的细胞明显增多。其生物学特性和患者的增殖期血管瘤的生物学特性相似,我们可以用该模型来研究血管瘤的防治和机理。
　　本实验进一步摸索了裸鼠血管瘤移植模型制作的最佳条件。在适当的外来雌激素的干预下,移植肿瘤表达稳定,有增殖性,同时载瘤小鼠生长良好。而建立的移植瘤模型能够存在足够的时间,为进一步研究血管瘤的生物学特点及其生长转归机制,以及利用它进行血管瘤防治的临床研究提供了很好的条件。
　　
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　　[收稿日期]2009-10-26[修回日期]2010-01-12
　　编辑/张惠娟