长脉宽1064激光_肥大细胞在长脉宽1064nm,Nd:YAG激光非剥脱性嫩肤中的作用

　　[摘要]目的:本研究的目的是探讨肥大细胞在非剥脱性激光嫩肤中的作用。方法:应用长脉宽1 064nm掺钕:钇-铝石榴石(neodymium-yttrium-aluminum garnet, Nd:YAG)激光对36只雌性昆明小鼠进行连续4次治疗,每次间隔1周。分别于第1次治疗后1h、1天、7天、21天、30天、60天对小鼠皮肤行活组织取材。应用甲苯胺蓝特殊染色、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫组化方法分别对皮肤组织样品真皮肥大细胞、成纤维细胞和I型、III型胶原进行检测。结果:激光治疗后1h、1天、7天、21天和30天,治疗组真皮肥大细胞总数较正常对照组明显增高(均为P 　　Key words: nonablative laser rejuvenation; collagen remodeling; mast cells; Nd:YAG laser; wound healing
　　
　　与传统的激光嫩肤技术即剥脱性激光嫩肤技术相比,非剥脱激光嫩肤技术具有疗效确切、副作用小的优点[1-2],因此在治疗光老化方面越来越受到广泛关注。关于非剥脱性激光与皮肤组织相互作用的方式,目前认为非剥脱性激光保持表皮的完整性,而只对真皮造成损伤,从而启动了机体的创伤修复反应,引起成纤维细胞增生、I型和III型胶原生成和真皮基质重建[3-4]。然而,非剥脱性激光确切的嫩肤机制目前仍不完全明了。
　　正常的创伤修复反应是一个复杂的生物学过程,其中有许多细胞及其产物参与。众所周知,肥大细胞是在免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)E介导的I型超敏反应中起中心作用的细胞,但近年的研究表明肥大细胞亦参与创伤愈合过程[5]。肥大细胞脱颗粒可诱导炎性反应、成纤维细胞增生和胶原重建,这恰是创伤愈合过程的关键步骤[5-6]。
　　本研究的目的是评价非剥脱性长脉宽1064nm Nd:YAG激光诱导真皮热创伤修复反应中肥大细胞的作用,以揭示非剥脱性激光的嫩肤机制。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 实验动物:雌性昆明小鼠36只,8～10周龄,体重约30g, 由复旦大学上海医学院实验动物中心提供,按取材时间点不同随机分6组,每组6只。
　　1.2 激光照射:实验前24h将小鼠背部皮肤应用市售脱毛膏行脱毛处理。在10%水合氯醛1ml/kg腹腔内注射麻醉下左侧皮肤行长脉宽1064nm Nd:YAG激光(Coolglide,Cutera公司, 美国)照射,右侧皮肤作为自身部位对照。根据文献[7]所描述的治疗参数进行激光照射。能量密度30J/cm2,脉宽0.3ms,光斑6mm。光斑有10%重叠,每个部位重复照射3遍。共治疗4次,每次间隔1周。第1次激光治疗后1h、1天、7天、21天、30天、60天分别对小鼠皮肤激光治疗组和正常对照组进行活组织取材,其中第3次和第4次取材是在相应的治疗前,以避免激光引起的急性炎症的影响。皮肤组织取下后立即放入10%福尔马林中固定。
　　1.3 皮肤组织病理检查:皮肤组织经固定、脱水、石蜡包埋,常规切片后行HE染色。组织切片中成纤维细胞核被染成蓝色,在400×显微镜下随机选取3个视野计数成纤维细胞核数,取平均值,代表成纤维细胞数。
　　1.4 甲苯胺蓝特殊染色:组织切片应用1%甲苯胺蓝染液进行染色,染色时间以肥大细胞异染颗粒呈紫红色为宜。每个切片随机选取20个视野,于200×显微镜下计数每个视野染色阳性细胞数,取平均值,即肥大细胞总数。然后在400×显微镜下对每个视野中脱颗粒的肥大细胞进行判定(脱颗粒的肥大细胞的判定参照文献[8],以400×下观察8个颗粒脱出到细胞膜外定义为脱颗粒的肥大细胞),取平均值,即为脱颗粒的肥大细胞数。
　　1.5 免疫组化实验:应用链酶亲和素-生物素-酶复合物(StreptAvidin-Biotin-enzyme Complex, SABC)染色试剂盒(博士德生物工程有限公司,武汉),一抗为兔抗小鼠I、III型胶原多克隆IgG抗体(博士德生物工程有限公司,武汉),实验步骤按说明书操作。实验结果应用Motic医学数字图像分析系统对DAB阳性染色的切片进行定量分析。400×下随机选取3个视野,分别计算小鼠真皮I、III型胶原阳性表达面积和统计场总面积的百分比,取平均值。
　　1.6 统计学处理:所测得的数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS15.0软件对数据进行t检验,不同变量间的相关性检验应用Pearson 相关分析,P 　　因为肥大细胞是急性炎症的敏感性指标,本研究中我们评估了激光治疗后1h和1天处于创伤愈合炎症期的肥大细胞变化。通过甲苯胺蓝特殊染色,我们发现肥大细胞总数在该期明显增加,提示激光照射可促进肥大细胞在真皮募集和浸润。关于脱颗粒的肥大细胞,在治疗组亦可见脱颗粒的肥大细胞较正常对照组明显升高,提示真皮肥大细胞参与急性炎症过程,原因是肥大细胞脱颗粒后预形成的介质通过多种作用而促进炎症的发生。
　　关于增生期和重建期,我们的研究表明治疗组肥大细胞总数在21～60天较正常对照组明显增高,治疗组脱颗粒的肥大细胞数量在7～60天较正常对照组明显增高,此结果是排除了急性炎症的影响而获得的,因为第3次和第4次取材是发生在相应的第3次和第4次治疗前。因此可以推测肥大细胞增多与创伤愈合增生期和重建期有关。
　　成纤维细胞增生是增生期的特征性表现,大量实验表明肥大细胞脱颗粒可诱导成纤维细胞增生[10-12]。肥大细胞可释放特异性促进成纤维细胞增生活性的物质,如组胺、类胰蛋白酶、白细胞介素(interleukin, IL)-1, IL-4 和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor , TNF)等细胞因子及转化生长因子(transforming growth factor, TGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等生长因子[11-16],这些介质可刺激成纤维细胞趋化、迁移、分化和生物合成活性。此外,肥大细胞与成纤维细胞毗邻,两种细胞之间存在缝隙连接,使两种细胞直接相互联系和功能上具有协同作用。通过HE染色,我们检测了激光治疗过程中成纤维细胞数量的变化,发现在7天至60天治疗组成纤维细胞数量较正常对照组明显增高。同时发现成纤维细胞与脱颗粒的肥大细胞的数量呈显著正相关。这些结果提示肥大细胞可能参与非剥脱性激光引起的成纤维细胞增生。
　　在重建期,肥大细胞脱颗粒在胶原的沉积和生成方面也起重要作用。在肥大细胞颗粒成分中,类胰蛋白酶能增强成纤维细胞I型胶原mRNA的表达[17]。最近的证据表明皮肤肥大细胞和类糜蛋白酶在创伤愈合过程中胶原纤维的合成方面起重要作用[18]。除类胰蛋白酶和类糜蛋白酶,多功能细胞因子如TGF, bFGF、IL-4和TNF也是潜在的刺激成纤维细胞细胞外基质合成和增加胶原生成的重要介质。关于本研究中的胶原重建,我们发现治疗组I型胶原在21～60天,III型胶原在7～60天较正常对照组明显升高。进而探讨真皮I型、III型胶原水平与脱颗粒的肥大细胞的相关性,我们发现真皮I型和III型胶原水平分别与脱颗粒的肥大细胞数量呈显著正相关。因此推测肥大细胞可能参与非剥脱性激光诱导的热创伤修复过程中的真皮胶原重建。
　　本研究中我们检测了非剥脱性激光引起的组织学改变以探讨其嫩肤的即时和长期机制。我们的结果表明非剥脱性激光诱导的热创伤在治疗组皮肤较正常对照组皮肤可激活更多的肥大细胞。当前的研究揭示真皮肥大细胞可能参与非剥脱性激光诱导的炎症反应、成纤维细胞增生和胶原重建。
　　
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　　[收稿日期]2010-02-25 [修回日期]2010-04-10
　　编辑/张惠娟
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