牙髓干细胞研究进展:牙髓干细胞

　　 干细胞是一类具有自我更新、高度增生能力和多相分化潜能的细胞,能够产生高度分化的功能细胞,包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前，已在体外成功地扩增出人体多种组织的成体干细胞,自从2000年Gronthos等[1]发现人牙髓组织中存在成体干细胞即牙髓干细胞( dental pulp stem cells,DPSCs)后 ，近十年来国内外学者对牙髓干细胞的培养、生物学特性、细胞表型、分化能力及重组为诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）等方面已进行了大量研究,本文就牙髓干细胞的研究现状综述如下。
　　
　　1 DPSCs的发现和生物学特性
　　牙髓是结缔组织,位于牙齿髓室和根管内，有一定修复再生的能力。由于成牙本质细胞是一种终末细胞,一旦分化后就不再分裂，因此普遍认为在成牙本质细胞遭受损伤后，牙髓内存在的未分化前体细胞可分化为成牙本质细胞，并分泌细胞基质。但直到2000年，Gronthos等[1]才首次正式提出DPSCs的概念,把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓细胞命名为DPSCs，在试验中应用酶消化法对成人第三磨牙牙髓细胞进行体外培养，并与骨髓基质干细胞( bone marrow stromal cells, BMSCs)进行比较,结果表明,这两种细胞具有相似的免疫表型，但DPSCs具有更高的克隆形成率和增生率,经体外诱导后能形成分散而高密度的钙化小结，当将DPSCs与HA /TCP支架共同培养后回植到小鼠背侧皮下，能观察到类似牙本-牙髓复合体样的结构。Miura等[2]发现人脱落乳牙(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)的牙髓中含有多能干细胞,具有高度增殖和克隆形成的特性，当将体外扩增的DPSCs 和SHED 与羟磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatite/tricalcium phosphate, HA/TCP)联合植入免疫缺陷小鼠的皮下时可形成牙本质- 牙髓样结构。Young等[3]分离猪第三磨牙牙胚，制备单细胞悬液，并接种到可降解的聚合物支架上，植入大鼠肠系膜内生长20～30周，可成功地构建出牙齿结构，包括含成熟牙釉质的釉器官、牙本质、成牙本质细胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨质细胞，证实了在猪第三磨牙有上皮和间充质干细胞的存在。
　　DPSCs 在形态上类似人骨髓成纤维细胞集落形成单位（colony forming unit fibroblast,CFU-F）[1]，大多数细胞呈长梭形，体积较小。透射电镜下，DPSCs 的核呈卵圆形，约占胞体体积的80%～90%，核仁大而明显，常染色质居中，异染色质少，分布于核周。胞浆很少，核浆比例大。细胞器较少，核糖体丰富,这些形态特征也体现了DPSCs的未分化或低分化状态。自我更新是干细胞的重要特性， Gronthos等[4]从3个月的原代DPSCs移植物中分离出基质样细胞,在体外培养扩增后植于小鼠皮下,结果形成牙本质-牙髓复合体样结构。对形成的牙本质样结构进行免疫组化检测, 发现其牙本质涎蛋白(dentin sialo protein,DSP)表达阳性,证实DPSCs具有自我更新能力。多向分化能力也是干细胞的特征之一，在不同的微环境下，DPSCs 可分化为多种细胞，矿化诱导培养基中，DPSCs能够形成与前期牙本质相似的球状矿化基质并表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）[5]；在脂肪诱导培养基中，DPSCs培养物中出现油红“O”阳性的脂滴，并伴随脂肪细胞特异性的pparγ2 和lpl基因表达上调；此外，DPSCs 还在mRNA 和蛋白水平表达神经前体细胞和神经胶质细胞的标志：神经巢蛋白（ nestin）和神经胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acid protein，GFAP），这说明体外培养的DPSCs有向神经样细胞分化的潜能[5]。其他学者也成功地诱导了DPSCs 向成牙本质细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化[6-7]。
　　
　　2 DPSCs的定位、分离和鉴定
　　 Gronthos等[1]推测DPSCs可能来源于血管周围的微环境(perivascular niche)。Shi等[8]研究发现，DPSCs和BMSCs存在于它们起源组织的微血管周围。Tecles等[6]选取拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分为三组：一组制备累及牙本质的浅洞，一组制备暴露牙髓的深洞，一组不做处理，分别观察牙髓内干细胞的活化和迁移，结果表明血管周围存在干细胞。干细胞表面的分子标记是鉴定和研究干细胞功能的重要手段，目前发现明确的干细胞标记不多，对DPSCs的标记物研究也不够深入。Gronthos等[1]应用免疫组化技术研究DPSCs的表面分子标记，并与BMSCs比较。结果表明，均表达与内皮细胞(血管细胞粘附分子1、CD146)、平滑肌细胞(α2平滑肌肌动蛋白)、骨细胞(碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨连接素、骨桥素、骨钙素)和成纤维细胞(Ⅲ型胶原、成纤维细胞生长因子2)有关的分子标记。DPSCs不表达骨基质蛋白、骨涎蛋白，而在BMSCs为低水平表达。用Northern blotting方法研究发现DPSCs不表达成牙本质细胞的特异性标记物牙本质涎磷蛋白( dentin sialophosphop rotein, DSPP)，说明DPSCs处于未分化状态,尚未分化为成熟的成牙本质细胞。为进一步比较DPSCs和BMSCs的性质，Shi等[7]应用基因芯片技术研究DPSCs和BMSCs的基因表达情况,发现两者在人类将近4 400个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细胞粘附分子、生长因子、转录调节因子等的基因。但同时发现，DPSCs较高表达ⅩⅤⅢα1型胶原、胰岛素样生长因子2、盘状结构域酪氨酸激酶、NAD ( P) H2维生素K3氧化还原酶、周期素依赖性蛋白激酶6等；BMSCs较高表达胰岛素样生长因子连接蛋白27和Ⅰα2型胶原。Liu等[9]研究发现,DPSCs分化时，初始Runx2、TGFβ相关基因、胶原代谢相关基因上调、碱性磷酸酶活性上升，后均下降；而细胞外基质磷糖蛋白(matrix extracellular phosphoglyco protein, MEPE)是DPSCs分化过程中唯一下降的标记物，作者认为MEPE是矿化的抑制剂,在DPSCs分化时下调，可作为DPSCs分化时的检测指标。最近Mokry 等[10]研究表明，牙髓干细胞表达STRO-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞的细胞标志物，同时表达Sox2, nestin及 nucleostemin干细胞标志物。
　　
　　3DPSCs的多向分化能力与相关因素的调控
　　牙髓干细胞是来源于神经嵴和间充质的多潜能干细胞[11]，研究发现其细胞群主要是来源于神经嵴细胞群，细胞标志物为low affinity nerve growth factor receptor (LANGFR)和间叶细胞群，标志物为1-integrin receptor subunit。这两个细胞群都具有多向分化的功能。牙髓干细胞的多项分化能力即可塑性(plasticity)在国内外的很多实验中得到验证。Yu等[12]认为牙髓干细胞的分化方向取决于局部的微环境，他们在试验中发现利用猪牙胚细胞条件培养基能诱导牙髓干细胞形成更加合理组织学结构的牙本质-牙髓复合体。Iohara等[13]研究发现，BMP2能够刺激牙髓细胞分化为表达牙本质涎磷蛋白DSPP的成牙本质细胞。Saito等[14]也发现,BMP2能促进牛和人单层培养和三维胶丸培养的牙髓细胞分化为成牙本质细胞。Keklikoglu等[15]认为转化因子AP21家族的成员FosB在成牙本质细胞和牙髓未分化间充质细胞的分化和增生方面有重要作用。Moioli等[16]的研究,TGF2β能诱导DPSCs向成牙本质细胞分化。Liu等[17]研究表明牙本质素是MEPE的一个肽片段,它能下调P16，促进DPSCs的增生，在牙髓修复中扮演重要角色。Gronthos等[1]发现DPSCs在含有L2抗坏血酸22磷酸、地塞米松、无机磷酸盐的矿化诱导液培养基中培养5～6周后,经染色表明有钙结节形成。Yamada 等[18]的研究表明，人DPSCs高表达DMP1，而DMP1在未分化间充质细胞分化和牙本质矿化中起重要作用。Arthur 等[19]体内和体外实验中，分别加入了各种生长因子如EGF及FGF等，均发现牙髓干细胞可以分化为具有功能活性的神经元。Francesca Paino等[20]认为黑素细胞和牙髓细胞均源于神经嵴细胞群，在试验中DPSCs在没有外加定向诱导因素下，表达TRP-2、TRP-1、gp100/Pmel and MART-1抗原，且能自主分化为完全成熟的黑素细胞。Demarco 等[21]最近研究把三维多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室内，用晶体盐或胶体做成孔剂辅料，把牙髓干细胞接种于其内，发现与牙本质相关的形态发生因子在诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化中起着重要的作用，且DPSCs的微环境对细胞的行为和分化也有重要的影响。Jing WANG等[22]用纳米纤维多聚乳酸支架进行DPSCs体内体外定向分化研究，发现BMP-7 和 DXM复合因子及纳米纤维多聚乳酸支架可大大提高DPSCs向牙髓牙本质复合体的定向分化能力。Gronthos等[23]实验成功对DPSCs进行了脂肪诱导，而Norsat等[24]证明DPSCs具有神经分化分化能力。
　　
　　4DPSCs向 iPSCs 的重组转化
　　诱导多潜能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子，以诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。由于iPSCs既避免免疫排斥，又不涉及伦理道德问题，因此具有广泛且重要的临床应用价值。在2006年日本学者Takahashi和Yamanaka[25]研究小组采用体外基因转染技术, 从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子, 通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞, 在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系, 该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似, 而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞, 故将其命名为iPSCs，从那开始全世界众多实验室开始了iPSCs研究[26-28]，相继从狗、猪、猴和人等哺乳动物的皮肤细胞、肝细胞、羊水细胞、CD34血细胞、骨髓干细胞及牙齿干细胞等成体细胞成功获得了iPSCs。其中牙髓组织在临床上易于获得，不牵涉伦理问题而得到广泛关注。Tamaoki[29]和Xing YAN等[30]研究小组利用病毒载体把c-Myc、Klf4、 Oct4、 Sox2 和Lin28、Nanog、Oct 4、 Sox2因子导入牙髓干细胞中，成功获得了iPSCs。
　　迄今为止，关于DPSCs的研究，国内外学者做了大量的工作，取得了很大的进展。但是DPSCs的研究仍面临许多问题,如DPSCs有无特异性细胞标志物? DPSCs的鉴定标准? DSPCs的潜在分化能力和如何定向诱导DPSCs的分化? Telomere在DPSCs体外培养和体内增殖过程中的作用机制？DPSCs向 iPSCs的成功转化载体和重组因子的优化？这些问题说明DPSCs应用于临床还有很长的路要走,需要相关学者更多的基础和临床研究。
　　
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　　[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-10
　　编辑/李阳利