帕金森病的干细胞移植治疗_帕金森病的症状

　　【中图分类号】R742.5 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)11－0084－01 　　 　　【关键词】帕金森病，干细胞治疗，文献综述
　　
　　 帕金森病又名震颤麻痹，是一种由于黑质多巴胺能神经元等进行性变性缺失所致的神经系统变性疾病，随着人口的老年化，其发病率呈逐年上升趋势。2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森组制定的诊断标准［1-2］：①运动减少。②至少符合以下1项：a：肌肉僵直；b：静止性震颤；c：姿势不稳。③至少符合以下4项中的3项：a：单侧起病；b：静止性震颤；c：逐渐进展；d：发病后多为持续性不对称性受累。尽管近10多年对帕金森病的发病机制认识及治疗手段探索均有长足的进步，但尚无法对其彻底根治。近年来对神经系统可塑性的研究及对神经再生和干细胞的认识逐渐加深，干细胞工程迅速发展。干细胞由于具有自我更新能力和多向分化潜能的特性，运用干细胞移植治疗帕金森病成为可能，极具发展前景和应用价值。
　　1 神经干细胞的特点
　　1.1 神经干细胞（NSCs）是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞，它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。Ourednik等认为神经干细胞是最适合于中枢神经系统细胞的替代治疗和基因治疗的细胞。
　　1.2 神经干细胞可直接来源于胚胎成年哺乳动物的脑组织。在补充适量的促有丝分裂试剂如碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子或白血病抑制因子后，神经干细胞可在无血清的或含血清的培养液中生长。另一个提高增殖和延长培养时间的方法是，在神经元祖细胞中转染增殖调节基因。V-myc基因可转染神经干细胞，建立长久分化的神经干细胞系。最近研究表明，源于胚胎中枢神经系统各区域的NSCs具有不同的分化潜能，中脑来源的NSCs（mesencephalic neural stem cells，mNSCs）更易于分化为DA神经元，是细胞移植治疗PD的理想细胞源。然而由于机体局部微环境的影响，仅少量mNSCs可在体内分化为DA神经元。
　　2 影响神经干细胞分化的因素
　　 首先，移植的神经干细胞的分化受其本身内在性质的影响。其次，神经干细胞所处的局部微环境因素和营养因素对神经干细胞的分裂和分化也具有一定的诱导作用。移植干细胞的分化与所处环境的神经类型和神经发育阶段有关。向体外培养的干细胞中加入不同组合的诱导因子如血清、组织提取液、各种细胞因子等，可使神经干细胞继续增值或向不同方向诱导分化。神经干细胞自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5％～5％，而在一定条件下，神经干细胞向多巴胺能神经元分化的比例甚至可达到80％。一些因子在多巴胺能神经元的分化中起作用。Nurrl和Ptx3等转录因子能够调节神经细胞向多巴胺能神经元分化。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是目前发现最强的DA神经营养因子，然而由于血脑屏障和脑组织结构的特点，使其应用受到了限制［3］。
　　3 神经干细胞移植后的生物学特性
　　 Alcksandrova 等［4］将源于胚胎大鼠和人胚的神经干细胞分别移植于新生及成年大鼠脑内，于移植后1个月应用放射自显影技术观察，发现源于胚胎大鼠的神经干细胞在移植到成年大鼠脑后并未停止发育，它能够继续分裂、迁移，形成神经元和胶质细胞，免疫组化显示它能够表达特异性的神经递质和神经肽。将来源于8～12周胚胎的人神经干细胞，移植前培养两周，然后将其移植入大鼠脑内，于移植后10～20d，光镜下，所有的受体脑内均可见培养的人神经干细胞。成簇的移植细胞位于尾状核、侧脑室、白质、脑皮质，移植的细胞周围可见巨噬细胞，但未见明显的免疫反应。移植细胞的浓度从注射区向周围逐渐减少干细胞中可见有丝分裂细胞，表明在新的微环境下干细胞仍有增殖潜能。大鼠和人神经干细胞移植于成年大鼠脑后，表现相似的生物学行为并分化为神经元和胶质细胞。移植后，两者都可以连续地进行有丝分裂，从移植区迁移至受体脑的周围组织。大鼠脑内移植可作为人神经干细胞发育的生物模型。Brustle等将源于8周人胚的神经干细胞移植入大鼠胚胎脑室，也可见有神经元的分化，移植细胞可以在轴突、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等各个水平广泛整合。
　　 成体中区神经系统中存在神经干细胞，也可以在体外培养扩增后移植到脑内。从成鼠前脑室下带中分离出神经干细胞，然后进行单细胞克隆、扩增、收集，分别移植至大鼠切割海马伞侧和正常侧的海马齿状回中，发现移植至海马齿状回中的神经干细胞能够存活，并可沿正常海马齿状回中固有的神经干细胞迁移路径即颗粒下层迁移。切割海马伞侧海马内存活和迁移的神经干细胞明显多于正常海马内的神经干细胞。提示切割海马伞侧海马齿状回内促进神经干细胞的存活并诱导其迁移、分化的物质增强。移植到小鼠嗅球的室管膜下区的神经干细胞可与该处的神经元发生广泛的整合。将神经干细胞移植入大鼠海马，观察到由神经干细胞分化来的神经元与宿主的神经元形成功能性的突触联系，体外实验也证实了这一点。所以，神经干细胞有望从解剖和功能上对受到损伤或变性的脑组织进行修复。移植的神经干细胞在大鼠脑内表现多巴胺的特性。Villa等［5］报道，应用V-myc转染的人胚神经干细胞，可以建立人神经干细胞系，使体外大量扩增神经干细胞成为可能。
　　 对于帕金森病，产生人多巴胺能神经元是我们治疗的主要目的。胚胎和成年脑组织干细胞均可产生多巴胺能神经元，从而为帕金森病的移植治疗提供细胞来源。在增殖时，这些细胞形成表达中枢神经系统祖细胞标记（nestin）免疫活性的细胞球。在包含有IL-1b，IL-11，LIF和GDNF等分化介质中可形成TH免疫活性的细胞，这些细胞表现为多巴胺能神经元的形态学和功能的特性，包括多巴胺的产生和释放。目前已经培育出分化为酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞比例达98%的单克隆神经干细胞系。这些细胞可进一步扩增，可在液氮中储存，复苏后可以重新扩增。这些单克隆细胞系移植后可产生更高的多巴胺水平。源于人胚胎中脑的神经干细胞也可移植于被毁损的大鼠脑内，成功地恢复多巴胺水平。
　　 利用神经干细胞作为基因治疗的载体是一种新兴的方法。在体外将外源基因导入神经干细胞，再经过培养、扩增，导入脑内，可以广泛用于中枢神经系统变性疾病及肿瘤的治疗。应用单个或多个外源基因对神经干细胞进行修饰，使其携带补充外源性多巴胺基因及营养因子基因，然后导入脑内，可用于帕金森病和阿尔茨海默病的治疗。植入的神经干细胞受局部微环境的影响，在植入部位分裂增殖为相应的神经细胞，补充和替代受损的细胞并与宿主的局部细胞整合，建立功能性突触联系；另一方面，外源基因在移植部位表达，发挥治疗作用。Park等将NT-3（神经营养素-3）转染神经干细胞，发现体外培养时分化为神经元的比例可达90%，移植到梗死灶后，有20%的细胞可向神经元方向分化，移植到缺血半暗带后，向神经元方向分化的比率可达80%。Ryu等［6］将TH联合GTPCH-1基因修饰的C17.2系NSC移植到PD鼠模型纹状体中，发现NSC能够很好的存活、迁移和分化，并能明显地改变动物行为。Kim等采用TH联合GTPCH-1基因修饰的永生化系mNSC（HB1.F3）移植治疗PD，能改善动物行为，并在移植区有大量的TH阳性细胞表达，表明NSC是基因治疗PD的有效理想载体。研究发现孤儿核受体（Nurr1）基因可促进NSC系如C17.2分化为DA神经元，减少其分化为胶质细胞的比例。Nurr1基因修饰后的胚胎干细胞分化为DA神经元的比例可从15%增至50%。这些神经元能表达中脑特异性的标志物，包括TH，Ret，Pitx3，Enl；而且将这些神经元移植到6-羟基多巴胺大鼠模型脑内可产生功能性整合，并出现行为学改善。因而Nurr1基因的移植可通过增加外源性DA神经元的数量对PD起治疗作用。O’KeeffeFE等［7］过度表达Pirx3于NSCs中，然后暴露于E11，这导致多巴胺能神经元细胞分化的明显增强，再植入6-羟基多巴胺毁损帕金森病大鼠脑内，导致明显运动功能恢复。另外，有大量Girkz阳性NSC起源的A9神经元在移植周围。这证明给予正确的信号，NSC能诱导成多巴胺能神经元。Li等通过腺病毒载体将Nurr1转染于NSC后，移植到6-羟基多巴胺大鼠模型脑内，发现其比单纯NSC移植治疗PD的病理学行为学改善更明显。胶质源性神经营养因子（GDNF）是目前发现针对DA神经元的一种最有效和特异性的神经营养因子。Liu等发现将表达NTN的C17.2-NSC植入PD模型鼠纹状体，移植细胞能够存活、分化，保护DA神经元，抵制6-羟基多巴胺对DA神经元的毒性并能改善动物旋转行为，其保护效果可持续4个月以上。褪黑素（MT）具有重要的免疫调节作用。Sharma等［8］应用MT联合C17.2-NSC移植治疗PD模型，发现对PD模型损害侧黑质纹状体的TH免疫反应有明显保护作用。目前，免疫调节蛋白或神经保护因子联合NSC用于细胞移植后免疫应答的调节也是PD细胞移植治疗的研究热点。
　　4 前景与展望
　　 神经干细胞移植治疗帕金森病目前已成为一种研究和治疗的方向，但对其分子机制、免疫排斥、移植诱导产生的运动性障碍等问题还需进一步研究。目前大部分结论都是基于动物实验的结果，能否在人类身上得到类似或更好的结果还尚未可知，在实用性、技术、神经生物学等方面存在一些问题。但随着分子生物学、基因工程技术的发展和对神经干细胞及帕金森病治疗研究的深入，特别是近来对移植诱导产生的运动性障碍的鉴定以及分化至多巴胺能神经元的新方法的出现［9］，有望对神经干细胞移植治疗帕金森病的研究产生更好的推动作用。
　　
　　参考文献
　　［1］ 中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组，帕金森病的诊断［J］.中华神经科杂志，2006，39（6）；408-409
　　［2］ 王新德，帕金森病和帕金森综合症的诊断标准和鉴别诊断［J］中华神经精神科杂志，1985，18（4）;255
　　［3］ 邓兴力等，神经干细胞联合多巴胺神经元移植治疗帕金森病的实验研究［J］. 昆明医学院，2008，28（5）
　　［4］ ALCKSANDROVA MA,SABURINA IN,KOROCHKIN LI,etal.Behavior and differentiation of the neural stem cells in vivo［J］.Biology Bulletin,2001,28(6） :553- 560.
　　［5］ VILLA A,SNYDER EY,VESCOVI A,et al.Establishment and properties of a growth factor- dependent,perpetual neural stem cell line from human CNS［J］.Exp Neurol,2000,161:67- 84.
　　［6］ RYU MY，LEE MA,AHN YH,et al.Brain transplantation ofneural stem cells cotransduced with tyrosine hydroxylase and GTP cyclohydrolase in Parkinsonian rats［J］.Cell Transplant, 2005,14(4)：193- 202。
　　［7］ O"KEEFFE FE，SCOTT SA，TVERS P.Induction of A9 dopaminergic neurons fromneural stemcells improves motorfunction in an animal model of Parkinson"s disease［J］.Brain,2008，131 （3） :630- 641.
　　［8］ SHARMA R,MCMILLAN CR,NILES LP.Neural stem cell transplantation and melatonin treatment in a 6 hydroxydopamine model of Parkinson disease［J］.J Pineal Res,2007,43(3):245- 254.
　　［9］ Allan LE, Petit GH, Brundin P. Cell transplantation in Parkinson"s disease: problems and perspectives. ［J］.Curr Opin Neurol. 2010 May 19. ［Epub ahead of print］
　　
　　作者单位 422400 湖南省武冈市展辉医院神经外科1
　　 510000 中国人民解放军广州军区广州总院神经外科2