多巴染色与光密度法在细胞水平评价原料美白功效的应用研究 多巴反应阳性黑素细胞

　　[摘要]目的：在细胞水平评价化妆品原料的美白功效。方法：体外培养小鼠黑素瘤细胞B16，通过多巴特异性染色，利用平均光密度法检测化妆品原料对细胞中黑素生成的抑制作用。结果：多巴对细胞内黑素具有特异性染色，浓度为25μg/ml的曲酸对黑素细胞内黑素生成的抑制率为（48.44±3.44）%，板内标准偏差值仅为7.09%，板间标准偏差值小于7.22%，曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物均对细胞内黑素的生成具有较为明显的抑制作用，而桑白皮提取物对细胞内黑素生成几乎没有抑制作用。结论：采用多巴染色和平均光密度的方法检测黑素瘤细胞中黑素含量，精度较高、板间板内误差较小，能够成功用于化妆品原料美白功效的评测。
　　[关键词]多巴染色；光密度法；黑素生成；小鼠黑素瘤细胞
　　[中图分类号]Q933-333[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）07-1114-04
　　
　　Assessment of whitening efficacy of cosmetical materials in B16 melanoma cells
　　LIU Rong, SUN Jian-ning, GUO Ya-jian
　　(School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing100102,China)
　　
　　Abstract: Objective To assess the whitening efficacy of cosmetical materials in B16 melanoma cells. Methods B16 melanoma cells were cultured in vitro, and the inhibition of cosmetical materials on the melanogenesis was measured with L-Dopa dying and mean optical density method. ResultsMelanin could be dyed by L-Dopa specifically in B16 melanoma cells, and the inhibition of Kojic acid with concentration of 25μg/ml on the melanogenesis was (48.44±3.44)%, and the RSD within and between the plate were 7.09% and 7.22%, respectively. Kojic acid, Resveratrol and Camellia sinensis extract could inhibit the melanogenesis effectively, while White mulberry root-bark extract didn"t have any inhibition effect on the melanogenesis.ConclusionsThe content of melanin in B16 melanoma cells was measured with L-Dopa dying and mean optical density method, which is proven to be higher sensitivity and lower error，and could be used for the assessment of cosmetical materials on the whitening efficacy successfully.
　　Key words：L-Dopa dying; optical density; melanogenesis; melanoma cells
　　
　　随着人们生活品质的日益提高，功能性化妆品如美白类化妆品越来越受到消费者的关注和青睐。对美白类化妆品中有效成分的功效评价方法很多，包括体外酶抑制法[1]、细胞法[2]、豚鼠动物法[3]及人体实验法[4]等。其中，细胞法以其高效率、较低成本、体内高相关度等优点，逐渐成为评价美白成分功效的主要方法。传统的细胞法采用NaOH直接溶解经过超声裂解后的细胞内黑素，通过光度法来检测细胞内黑素含量的变化，这种方法在实际操作过程中，由于黑素本身很难溶解，在溶解过程中必须采用加热超声等助溶手段，此外细胞裂解后产生的不溶性胞体蛋白物质也和黑素在离心过程中一同沉淀，很难分离，这些都对黑素含量的检测产生了很大的影响，导致结果误差较大。为了克服上述缺陷，本文采用多巴染色和光密度相结合的方法来表征细胞内黑素的含量，并利用这一方法对数种中草药的美白功效进行了评价。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 药品、试剂与仪器： DMEM培养基（Gibco公司），新生牛血清（Gibco公司），胰酶（Gibco公司），L-多巴（Sigma公司），桑白皮提取物（由杭州迪康生物技术有限公司提供），绿茶提取物（由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供），曲酸（由北京贝丽莱斯公司提供），白藜芦醇（由常州生物公司提供），其余试剂均为市售分析纯。酶标仪（Bio-Rad 680，美国伯乐公司），倒置生物显微镜（XDS型，重庆光电仪器总公司），二氧化碳培养箱（MCO-15AC型，日本三洋公司），超净工作台（SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司）。
　　1.2细胞来源：小鼠B16黑素瘤细胞株，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。人永生化表皮细胞HaCat，购自武汉中国典型培养物保藏中心。
　　1.3 细胞培养方法：在无菌条件下，将细胞接种于含10%（体积分数）新生牛血清的DMEM培养基的培养瓶中，置于CO2培养箱37℃，5%CO2饱和湿度环境中进行培养，每3天用0.25%胰酶消化传代一次。待细胞生长到对数期，用PBS缓冲液（1/15M，pH=6.8）洗涤，0.25%胰酶消化，细胞计数板计数后，用于铺板及后续实验。
　　1.4 细胞多巴染色以及黑素含量检测方法：将细胞在37℃，5%CO2的培养箱中培养。72h后，倾去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，采用L-多巴染色：①用4%甲醛 PBS溶液固定细胞15min；②用去离子水冲洗3次后；③加入0.1%多巴溶液染色3.5h；④用10mM PBS溶液和去离子水各冲洗一次。然后，用显微镜100倍拍照，采用Image-Pro Plus6.0软件对图像进行分析，黑素含量用平均光密度(平均光密度=累积光密度/面积)表示。每个样品随机拍摄30张照片进行分析。
　　1.5 多巴染色特异性考察：在6孔培养板中分别接种小鼠黑素瘤细胞B16或人永生化表皮细胞HaCat，接种密度为25 000个/孔，平行3个复孔，将细胞在37℃，5%CO2的培养箱中培养。72h后，倾去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，采用L-多巴染色和平均光密度法评测细胞黑素含量。
　　1.6 多巴染色法对细胞内黑素含量评测重现性考察：在6孔培养板中接种小鼠黑素瘤细胞B16，接种密度为25 000个/孔，培养24h待贴壁后，倾去培养液，分别加入含25μg/ml曲酸继续培养72h后，采用L-多巴染色，每个样品做3个复孔，平行做3块板，未加曲酸样品的为对照孔，利用Image-Pro Plus6.0软件对照片进行分析，计算平均光密度值和黑素生成抑制率。
　　1.7 原料对B16细胞黑素生成的抑制率测定方法：在6孔培养板中接种小鼠黑素瘤细胞B16，接种密度为25 000个/孔，24h待细胞贴壁后，每孔分别加入含不同浓度所测原料的培养液，以不加所测原料的培养液作为对照，平行3个复孔，将细胞在37℃，5%CO2的培养箱中培养。72h后，倾去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，采用L-多巴染色。然后，用显微镜100倍拍照，采用Image-Pro Plus6.0软件对照片进行分析，计算平均光密度值和黑素生成抑制率。
　　1.8 统计学处理:数据采用Origin8.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，两组间数据比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　2.1多巴染色特异性结果：多巴对小鼠黑素瘤细胞B16和人永生化表皮细胞HaCat染色特异性结果如图1所示。染色后平均光密度值分别为0.35±0.02,0.02±0.01。
　　由图可见，多巴能对小鼠黑素瘤细胞B16内的黑素进行特异性染色，而细胞的其他组分对染色不会产生干扰作用，表明多巴染色法可用于细胞内黑素的特异性染色，而且平均光密度值与黑素含量正相关。
　　2.2多巴染色法对细胞内黑素含量检测重现性结果：以浓度为25μg/ml的曲酸作为样品，考察多巴染色法在评价原料对细胞内黑素含量生成抑制作用的重现性，结果如图2、图3和表1所示。
　　由图2、图3和表1可知，浓度为25μg/ml的曲酸能够明显抑制黑素瘤细胞内黑素的生成，抑制率为（48.44±3.44）%，且板间标准偏差值仅为7.09%，板内标准偏差值小于7.22%，这充分表明采用多巴染色法对黑素细胞进行染色后，运用Image-Pro Plus6.0软件工具对黑素平均光密度进行表征，进而计算化妆品原料对细胞内黑素生成的抑制率，具有较好的板间和板内重现性，可以用于在细胞水平评价化妆品原料的美白功效。
　　2.3 各原料对黑素细胞内黑素生成的抑制率：采用多巴染色法分别考察了曲酸、白藜芦醇、桑白皮提取物、绿茶提取物对细胞内黑素生成的抑制作用，曲酸结果见图4、图5，白藜芦醇结果见图6，桑白皮提取物结果见图7，绿茶提取物结果见图8。
　　由图可见，当曲酸浓度大于6.25μg/ml时，其对黑素生成抑制率为(45.18±4.68)%；当白藜芦醇浓度大于0.63μg/ml时，其对黑素生成抑制率保持在(38.29±6.44)%左右；当绿茶提取物浓度大于25μg/ml时，其对黑素生成抑制率保持在（24.18±5.55）%左右。结果表明，曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物均对细胞内黑素的生成具有较为明显的抑制作用，而桑白皮提取物对细胞内黑素生成几乎没有抑制作用。
　　
　　3讨论
　　细胞法已成为评价化妆品原料美白功效的主要方法之一，通过检测细胞内黑素含量的变化，达到评测一种原料是否具有美白或黑素沉积的功效。培养细胞一般使用人体皮肤黑素细胞、黑素瘤细胞及小鼠黑素瘤细胞B16等，在以筛选和评价为目的使用时，又以易于培养的小鼠黑素瘤细胞B16最为合适[5]。常用的细胞内黑素检测方法是用NaOH直接溶解经过超声裂解后的细胞内黑素，而后通过光度法来检测，但是这种方法干扰因素众多、精度低、误差很大。为了克服上述缺陷，本文采用多巴染色和光密度相结合的方法来表征细胞内黑素的含量。通过与人永生化表皮细胞HaCat的对比，确认了多巴对于黑素瘤细胞中的黑素具有染色特异性。在黑素合成过程中，酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下氧化为多巴，多巴经酪氨酸酶作用转化为多巴醌，在通过一系列后续反应最终生成黑素[6]。
　　在活体皮肤组织内，只有位于表皮基底细胞之间的黑素细胞富含较为丰富的酪氨酸酶，是唯一的多巴阳性细胞，因此采用多巴对黑素细胞染色具有细胞特异性[7]。同时由于多巴染色后颜色的深浅与黑素细胞内酪氨酸酶的活性正相关，也间接与黑素含量正相关，因此可以用多巴染色后黑素细胞的颜色深浅变化来表示细胞内黑素含量的变化。黑素细胞的颜色深浅变化可以采用图像法进行分析，这也是分析免疫组化照片的常用技术，具体到黑素细胞颜色分析，可以采用平均光密度法进行表征，即染色后黑素细胞的累积光密度除以所测细胞面积得到平均光密度值，实验结果表明，采用该指标表征黑素细胞颜色深浅变化具有良好的板间和板内重现性，这进一步说明采用多巴染色法在细胞水平上用于评测化妆品原料对黑素生成的抑制作用进而评测其美白功效具有良好的可行性，这为接来下采用该法评价中草药美白功效提供了方法上的基础。
　　通过细胞法评测，结果表明曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物均对细胞内黑素的生成具有较为明显的抑制作用，而桑白皮提取物对细胞内黑素生成几乎没有抑制作用。在体外实验中，以L-多巴为底物，测得曲酸、白藜芦醇、绿茶提取物和桑白皮提取物对酪氨酸酶活性的半数抑制浓度（IC50值）分别为4.88μg/ml、30.61μg/ml、75.48μg/ml和356.06μg/ml（数据未发表）。通过曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物可以发现体外和细胞实验结果具有较好的相关性。值得注意的是，尽管桑白皮提取物虽然对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，但是在细胞实验中对黑素的生成几乎没有抑制作用，这可能与其透细胞膜能力或者与细胞表面受体结合能力有关。
　　综上，采用多巴染色和平均光密度的方法检测黑素瘤细胞中黑素含量，精度较高、板间板内误差较小、同时具有染色特异性，能够成功用于化妆品原料的美白功效的评测。
　　
　　[参考文献]
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　　[2]涂彩霞,张荣鑫,于志红,等.18味中药乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响[J].中华皮肤科杂志, 2006,39(7):400-402.
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　　[6]Stamatas GN,Zmudzka BZ,Kollias N,et al.Non-invasive measurements of skin pigmentation in situ[J].Pigment Cell Res,2004,17:618-626.
　　[7]Prota G. Melanins, melanogenesis and skin photoprotection[J].Eur J Cancer,1994,30A: 553-554.
　　[8]董妙珠,肖 萍,洪新宇,等.不同染色法检测豚鼠皮肤黑色素的比较研究[J].环境与职业医学,2006,23(5):423-425.
　　
　　[收稿日期]2011-03-20[修回日期]2011-05-13
　　编辑/李阳利