成纤维细胞的超微结构_ＩＬ－１对病理性瘢痕成纤维细胞超微结构的影响

　　(第一军医大学南方医院整形外科　广州510515) 　　杨东元　男,1967年生。1991年毕业于第四军医大学军医系,1996年毕业于第一军医大学,获外科学医学硕士学位,现工作于南方医院整形外科。参加两项国家自然科学基金项目和一项国家卫生部电教教材制作项目;发表于国家一类杂志论文6篇。[摘　要]　目的:阐明白细胞介素-1对病理性瘢痕效应的作用机理。　方法:观察白细胞介素-1对病理性瘢痕成纤维细胞超微结构的影响。　结果:该介素明显破坏了线粒体、粗面内质网、核糖体等重要细胞器。　结论:证明白细胞介素-1是成纤维细胞合成胶原的负性调节因子。
　　[关键词]　白细胞介素-1　病理性瘢痕成纤维细胞　超微结构
　　[中图分类号]R322.99　[文献标识码]A　[文章编号]1008-6455(2000)05-0324-02
　　
　　THE EFFECTS OF INTERLEUKIN-1 ON THE ULTRASTRUCTURE
　　OF CULTURED FIBROBLASTS FROM PATHOLOGICAL SCAR
　　YANG Dong-yuan　LUO Jin-hui　GAO Jian-hua　ZHANG et al.
　　The Plastic Surgery Department of Nanfang Hospital,The First Military
　　Medical University(Guangzhou 510515)
　　[Abstract]　Objective:To investigate the effects of interleukin-1 on the ultrastructure of cultured fibroblasts from pathological scar.　Methods:Transmission election microscope were used to observe the ultrastructure of FB.　Results:After treatment with IL-1,the main cell organs,including rough endoplasmic reticular,mitochondrid and ribosome,were destroyed.　Conclusion:IL-1 is a negative regulator in collagen synthesis of fibroblasts.It could be used for the treatment and the prevention of pathologic scar.
　　[Key words]　Interleukin-1　Ultrastructure　Fibroblast　Pathological scar
　　细胞因子介导的免疫应答在病理性瘢痕的形成中起着调控作用[1],部分学者认为其中的白细胞介素-1(Interleukin-1简称IL-1)为胶原合成的负性调节因子,能刺激瘢痕成纤维细胞内胶原酶的合成[2],抑制前胶原蛋白的合成[3],但也有不同的见解。我们以体外二维培养的病理性瘢痕成纤维细胞为实验对象,研究了白细胞介素-1对其超微结构的影响,探讨白细胞介素-1对病理性瘢痕效应的作用机理,为临床应用它治疗病理性瘢痕提供理论依据。
　　
　　1　材料与方法
　　1.1　试剂与材料　本实验所用增殖性瘢痕或瘢痕疙瘩标本均取自第一军医大学南方医院整形外科病人;白细胞介素-1(北京北方同正生物技术发展公司)、DMEM培养基干粉(美国GIBCO公司)、L-谷氨酰胺(中国科学院上海生物化学研究所)、新生小牛血清(超级;杭州四季青生物工程研究所)、HEPES(香港FARCO公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)
　　1.2　成纤维细胞的体外二维培养
　　1.2.1　原代培养　将手术切除的瘢痕组织,在无菌条件下剪成0.5cm3～1.0cm3的小块,立即投入含100U/ml青、链霉素的培养液中。剪除脂肪、表皮及结缔组织,D-Hanks液清洗至无油滴,反复剪碎至小于1mm3的小块,同时加数滴血清,按适当间隔接种于培养瓶壁上,反转使有组织块的一面向上,加入含20%FBS的DMEM培养基3ml,置37℃、95%空气、5%CO2、饱和湿度6～8小时后,轻轻倒转,使培养液浸没组织块,待培养液变黄后更换。4～10天组织块周围萌出细胞并逐渐形成细胞晕,20～30天细胞长满瓶,形成细胞单层。
　　1.2.2　传代培养　加入0.25%胰蛋白酶消化约0.5min,细胞收缩变圆后弃去胰酶,加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化并轻轻吹打,形成细胞悬液。按1∶3比例传代,建立病理性瘢痕成纤维细胞的传代细胞系,实验用第4～15代细胞。
　　1.2.3　白细胞介素-1对成纤维细胞的处理　将5000个/ml的细胞悬液,分别加入24孔培养板各孔中,贴壁后均弃上清。前8孔为实验组1,加入含IL-1 100U/ml的条件培养基;中间8孔为实验组2,加入含IL-1 200U/ml的条件培养基;后8孔为对照组,加入普通培养基。24小时后消化成细胞悬液分别收集。
　　1.2.4　成纤维细胞电镜样品的制备　将各组悬液分别转入离心管中的琼脂管内,以800R/min低速离心10min;弃上清,各加入2.5%戊二醛0.5ml,室温固定5小时,弃上清,烧热的玻棒轻划琼脂管内壁,使融化的琼脂流下,包埋住管底的细胞团;用特制的薄铁片将琼脂管剥离出;切除多余的琼脂,形成细胞琼脂凝胶包埋块,将包埋块切成1mm3的小块,置1%四氧化锇中固定1.5小时,常规脱水、浸透、包埋、超薄切片、铀铅染色,透射电子显微镜(TEM)观察。
　　
　　2　结果�对照组细胞浆内具有丰富的粗面内质网和线粒体,内质网呈密集小管状,平行排列;线粒体较多,呈卵圆形,具有环形嵴;还可见溶酶体等结构。细胞核呈圆形或卵圆形,核质均匀细致,核仁清晰呈网状。�实验组1细胞有不同程度的损伤,胞浆内出现较多较大的空泡,线粒体肿胀或消失;粗面内质网明显扩张,数量减少。实验组2线粒体环形嵴退化、变形或消失;粗面内质网裂解、空泡化;粗面内质网表面核糖体解聚、脱落;细胞膜和细胞核仍保持其完整性。
　　
　　3　讨论�病理性瘢痕是以胶原等大量细胞外基质过度产生和沉积为特征的皮肤纤维化疾病[4],是美容整形外科的主要难题。成纤维细胞摄取合成蛋白所需的脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸等,在粗面内质网的核糖体上按照特定的胶原mRNA信息排列,合成前α多肽链。后者边合成边进入粗面内质网内,经羟化酶羟化,三条前α多肽链互相拧成绳索状的前胶原蛋白分子,再转移到高尔基复合体中加上糖基,经胞吐方式分泌到细胞间质。线粒体是细胞进行生物氧化及提供生命活动所需能量的场所,三羧酸循环、呼吸链电子传递及氧化磷酸化都在线粒体内进行,线粒体、内质网和核糖体超微结构的变化对成纤维细胞合成胶原蛋白的功能具有重要的意义。本研究透射电镜显示,实验组细胞超微结构形态有明显变化,表现为粗面内质网扩张、囊泡化;线粒体肿胀、空泡化;核糖体脱颗粒、解聚;其它细胞器均有不同程度的破坏,并与用药剂量呈正相关。这说明白细胞介素-1是通过破坏前胶原蛋白合成的场所-粗面内质网和核糖体及细胞活动的能量中心-线粒体来抑制瘢痕成纤维细胞前胶原蛋白的生成,即白细胞介素-1为胶原合成的负性调节因子。这一结果与我们从定量免疫细胞化学角度研究白介-1对瘢痕成纤维细胞内前胶原蛋白影响的结论相吻合[5]。�综上所述,白细胞介素-1通过对前胶原蛋白合成的负性调节抑制了胶原的生成,该作用至少发生于翻译水平,这一结果为临床应用白细胞介素-1防治病理性瘢痕提供了一定的理论依据。
　　[参考文献]
　　1　Zhang K,Carner W,Cohen L et al.Increased type I and Ⅲ collagen and transforming growth factor-β1 mRNA and protein in hypertrophic burn scar.J Invest Dermatol,1995;104:750
　　2　Arhold E.Interleukin-1 stimulation of collagenase production by cultured fibroblast.Journal of Experimental Medicine,1983;157:801
　　3　R.Bhatnagar.Interleukin-1 inhibits the synthesis of collagen by fibroblasts[J].Biochemistry International,1986;13:709
　　4　Reckwell WB,Cohen IK.Keloids and hypertrophic scars:a comprehensive review[J].Plast Reconstr Surg,1989;84:827
　　5　杨东元,罗锦辉.白细胞介-1对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响[J].中华整形烧伤外科杂志,1999;15:434。
　　
　　收稿日期　2000-05-09
　　编辑/樊延南