[ＲＮＡ干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞ＣＴＧＦ表达和胶原合成的影响]成纤维细胞名词解释

　　[摘要]目的：研究结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）siRNA表达载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞（Human keloid fibroblasts，HKFs）中CTGF表达、胶原蛋白分泌的影响。方法：根据RNA干扰(RNA interference, RNAi)设计原则，设计并构建特异性CTGF siRNA表达载体，转染体外培养HKFs。用荧光实时定量PCR分析细胞中CTGF mRNA表达水平，3H-脯氨酸掺入法测定细胞胶原蛋白分泌水平。结果：与质粒组和对照组比较， CTGF siRNA表达载体组的CTGF mRNA表达降低约59.9%（P＜0.05）,胶原蛋白分泌明显下降（P＜0.05）。结论： CTGF siRNA表达载体能明显抑制HKFs中CTGF表达及胶原蛋白分泌水平，有可能成为临床上治疗瘢痕疙瘩的新方法。
　　[关键词]基因疗法；结缔组织生长因子；人瘢痕成纤维细胞
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-03
　　
　　Impact of RNAi on CTGF expression and collagen secretion in HKFs
　　ZHAO Ping，LI Shi-rong
　　（Department of Plastic Surgery, Southwest of Third Military Medical University, Chongqing400038,China）
　　
　　Abstract:ObjectiveTo study the effect of the constructed vecrors expressing siRNA of connective tissue growth factor(CTGF) on CTGF mRNA level and collagen secretion in HKFs.MethodsVectors expressing CTGF siRNA were designed, constructed andtransfected into HKFs. The real-time fluorescent quantitative PCR（RQ-PCR）was performed to detect CTGFmRNA level. The collagen secretion was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsThe CTGFmRNA level and the collagen secretion of vecrors group were markedly lower than those of plasmids group（both P＜0.05）.ConclusionVectors expressing CTGF siRNA can inhibit CTGFmRNA level and the collagen secretion in HKFs. This may be a new way to treat keloid.
　　Key words: gene therapy；Connective tissue growth factor(CTGF)；HKFs
　　
　　瘢痕疙瘩（Keloid KD）是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化。其发病机理尚不十分清楚，常严重毁损患者容颜，引发功能障碍，是整形外科领域的治疗重点和难点。CTGF是一种重要的促纤维化因子，通过TGF/SMADs途径参与病理性瘢痕的形成，阻断CTGF的产生及其促纤维化效应可能为今后病理性瘢痕的治疗提供了一个新的靶点[1]。本研究旨在构建CTGF siRNA表达载体，转染导入HKFs中，观察其对细胞内CTGF的表达和胶原蛋白分泌的影响，并探讨有关机制，为临床上防治瘢痕疙瘩提供新的途径。
　　
　　1资料和方法
　　
　　1.1 主要试剂：质粒pGenesil-1（武汉晶赛生物公司），Dosper脂质体（Roche,德国），DMEM高糖培养基（Gibco,美国），Trizol试剂、SYBRGreenⅠ荧光染料、RT-PCR试剂盒(Invitrogen,美国)，3H-脯氨酸（上海原子能研究所）。
　　1.2 CTGF siRNA表达载体的构建和鉴定：根据RNAi设计原则，用生物信息学方法在GeneBank中找到CTGF基因编码序列(登录号:NM_001901)，选择编码区内以起始密码ATG后100bp始至终止密码前100bp止的一段序列作为候选区，输入在线设计网站http://www.省略，寻找出的序列再经BLAST比对。最后将筛选出的3条序列分别设计3对64nt寡核苷酸，送上海生工合成。每条寡核苷酸包括：两端用于形成酶切位点（BamHI和HindIII）的序列，作为终止信号的5个胸嘧啶核苷(T)，两个反向互补排列的21ntCTGF特异性序列由一个9nt的间区隔开,用于形成茎环结构。将寡核苷酸退火结合形成双链，将环状质粒pGenesil-1用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶回收大片段。将退火片段与线性化载体进行连接，构建CTGF siRNA表达载体，酶切及测序鉴定正确后转染细胞，筛选出抑制效率最高的靶序列AAAGTGCATCCGTACTCCCAA。
　　1.3 细胞培养：选用瘢痕疙瘩患者（诊断标准参见文献[2]）术中切除的瘢痕组织，于无感染及溃疡处取材，组织法分离HKFs，加入10%小牛血清的DMEM培养基，培养条件为37℃ 5%CO2，待细胞融合后，0.25%胰酶溶液消化并按1:3传代，传代后细胞均匀接种，取体外培养第5代细胞用于实验。
　　1.4基因转染
　　1.4.1 实验分组：对照组:单纯DMEM培养基+脂质体；空质粒组：转染pGenesil-1空质粒；表达载体组：转染CTGF siRNA表达载体。
　　1.4.2基因转染
　　1.4.2.1 制备空质粒（表达载体）+脂质体复合物：采用无血清、无抗生素的DMEM培养液分别稀释空质粒（表达载体）和Dosper脂质体，室温下静置30min后等量混匀形成复合物。
　　1.4.2.2 转染：用0.25%胰酶消化单层培养细胞，以含10%小牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，将细胞以3×106/ml的密度接种于25cm2细胞培养瓶孔板。在37℃ 5%CO2的饱和水汽培养箱中培养至70%～80%融合时根据实验分组转染细胞，继续培养至预定时相点。
　　1.5HKFs中CTGFmRNA的测定
　　1.5.1 总RNA提取：收集细胞，以Trizol试剂提取总RNA，于波长260、280nm处测定吸光度（A）值，计算核酸纯度A260/A280为1.8～2.0，置-70℃保存备用。
　　1.5.2 逆转录反应：反应条件为30℃10min、60℃25min、99℃5min、5℃ 5min。
　　1.5.3 实时荧光定量PCR检测：Primer5.0软件设计CTGF引物序列，正向为5"-CCCGCAGTGCCAACCATGAC -3"，反向为5"-GCAGCCGCAGCCGTCCAG-3"，扩增片段长度为184bp；内参三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的引物序列正向为5"-CGCGGGGCTCTCCA -GAACAT-3"，反向为5"-CTCCGACGCCTGCTTCACCA-3"，扩增片段长度为204bp。反应过程为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循环28次，72℃延伸10min。SYBRGreenⅠ荧光染料技术行实时定量PCR反应,同样样本做3复管，ABI7500 荧光定量PCR仪检测,计算机分析ΔCt值:每个反应管内荧光强度达到系统所能检测到的域值时所经历的循环数-内参的循环数。
　　1.6 HKFs的胶原含量的测定：于各组细胞中加入含有0.5μCi的H3-脯氨酸溶液10μl，维生素C、β氨基丙�混合液100μl,每组设5个复孔，继续培养24h。以多头细胞收集器收集样本并干燥，经闪烁液处理后送液体闪烁计数仪检测。
　　1.7统计学处理：采用SPSS10.0统计软件包，实验计量结果采用以x±s表示。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 CTGF siRNA表达载体对HKFs中CTGFmRNA表达的影响：定量结果显示，表达载体组的CTGFmRNA表达含量较空质粒组减少约59.9%（P＜0.05）；对照组和质粒组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
　　2.2 CTGF siRNA表达载体对HKFs胶原分泌的影响：表达载体组对HKFs的胶原分泌较空质粒组和对照组有明显抑制作用（P＜0.05），质粒组和对照组间差异无统计学意义（△P＞0.05）。见表2。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　RNA干扰是一种转录后基因沉默机制,即mRNA被结合后即被降解或被相应的反义RNAP蛋白质封闭,从而阻止mRNA修饰和翻译,这种RNA水平的基因调控比转录水平基因沉默现象更普遍[3]，具有特异性、高效性和方便性等显著特点。Takabatake等[4]就证明RNA干扰抑制基因表达的效果比反义寡核苷酸技术效率高1000倍以上。
　　人GTGF属于CNN（即刻早期基因）家族成员，其生物学效应主要表现在促进细胞有丝分裂和增生，诱导细胞黏附和凋亡，调节细胞外基质合成，诱导血管形成、软骨骨化和促进胚胎发育等诸多方面[5]。在皮肤纤维化方面，Colwell等[6]研究发现，在瘢痕疙瘩成纤维细胞中，结缔组织生长因子(CTGF)的表达比正常皮肤组织中提高约20倍，并且经TGF-β1刺激后，CTGF的表达可提高100倍以上，认为TGF-β1可能通过CTGF表达的提高促使瘢痕疙瘩的形成，而阻断CTGF的活性则可以减少病理性瘢痕的发生。而刘剑毅等[7]在脂质体介导下，将异硫氰酸荧光素标记的硫代磷酸化CTGF反义寡核苷酸转染至体外培养的HKFs中，结果发现CTGF反义寡核苷酸能够抑制HKFs的CTGF mRNA的表达和胶原合成。
　　许多实验已证实通过靶向抑制CTGF从而抑制纤维化的发生发展是理论上抗纤维化的有效形式，由于siRNA表达载体成功转染后可进行瞬时或稳定的基因沉默，因此相较于化学合成更有应用价值。
　　在本实验中，我们构建了特异性的CTGF siRNA表达载体，转染入瘢痕成纤维细胞。证实转染表达载体的瘢痕成纤维细胞的CTGFmRNA表达水平显著降低，与空质粒组相比，抑制效果十分明显，胶原蛋白分泌量相比也明显减少。提示茎环样结构的CTGF siRNA表达载体可在细胞内经Dicer酶切割自动加工成为siRNA分子, 特异性地与CTGFmRNA相结合, 降解CTGFmRNA,引发基因沉默或表达抑制，同时导致细胞外胶原分泌降低。这可能为临床上治疗瘢痕疙瘩提供了新方法。
　　
　　［参考文献］
　　[1]曹广信,王维精. CTGF与病理性瘢痕关系研究进展[J].中国美容医学,2006,15(10): 1211-1213.
　　[2]鲍卫汉. 实用瘢痕学[M].北京：北京医科大学出版社，2000：338-339.
　　[3]Leirdal M, Sioud M. Gene silencing in mammalian cells by performed small RNA duplexes[J]. Biochem Biophys RES Commun, 2002, 295:744-748.
　　[4]Takabatake Y, Isaka Y, Mizui M, Kawachi H, et al. Exploring RNA interference as a therapeutic strategy for renal disease[J]. Gene Ther, 2005,12(12):965-73.
　　[5]高 云,杨松林. 结缔组织生长因子与病理性瘢痕[J].中国组织工程研究与临床康复,2007，11(23): 4606-4609.
　　[6] Cohen L, Zhang K, Garner W, et al. Increased types Ⅰ and Ⅲ collagen and transforming growth factor-β, mRNA and protein in hypertrophic burn scar[J]. J Invest Dermatol, 1995,104:750-754.
　　[7]刘剑毅,李世荣,纪淑兴,等. 反义寡核苷酸对人K成纤维细胞CTGF基因表达和胶原合成的作用[J].中华烧伤杂志,2004,20(2): 72-75.
　　
　　[收稿日期]2008-02-13[修回日期]2008-04-20
　　编辑/张惠娟