芦荟苦素 芦荟苦素对黑素细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响

　　[摘要]目的：体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，观察芦荟苦素、熊果苷及茶多酚对此模型中黑素细胞的影响。方法：以包皮组织作为细胞来源，分别培养角质形成细胞、黑素细胞；体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果：黑素细胞与角质形成细胞混合培养5天后出现浅灰色，继续培养，颜色逐渐加深。三种退色剂对酪氨酸酶活性及黑素的合成均呈浓度依赖性抑制。结论：成功构建了黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，三种退色剂均对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成产生浓度依赖性抑制，以茶多酚作用最强，芦荟苦素次之。
　　[关键词]混合培养模型；黑素细胞；角质形成细胞；芦荟苦素；熊果苷；茶多酚
　　[中图分类号]Q343.6　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)03－0310-03
　　
　　黑素是决定皮肤颜色的最主要因素，生理情况下角质形成细胞(KC)通过分泌一些生长因子或细胞外基质成分，直接或间接地对黑素细胞形态、黑素合成和转运等活动进行调节。酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，催化酪氨酸羟化为多巴并进而形成多巴醌的反应，该酶的活性大小决定着黑素合成的数量。由于酪氨酸酶在黑素合成中的重要作用，许多退色剂通过抑制酪氨酸酶活性，从而减少黑素的形成。本实验以儿童包皮为组织来源分离培养的黑素细胞、角质形成细胞来构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型，模拟体内“表皮黑素单元”的结构，在此基础上，研究了芦荟苦素、熊果苷与茶多酚对黑素细胞(MC)的影响。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料
　　1．1．1　标本：取自包皮环切术切除的包皮组织(儿童：7～10岁)。
　　1．1．2　主要试剂与仪器：芦荟苦素(aloesin)购自深圳市荣格生物化学制品有限公司；熊果苷(arbutin)购自北京贝丽莱日用化工厂；茶多酚(TP)购自安徽红星药业有限责任公司；霍乱毒素(CT)、左旋多巴(L－Dopa)、Dispase酶、转铁蛋白购自美国Sigma公司；碱性成纤维细胞生长因(bFGF)购自珠海亿胜生物制药公司；重组人表皮生长因子(EGF)购自深圳市华生元基因工程发展有限公司；小鼠抗人细胞角蛋白单抗AE1/AE3、SP奥抗试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中山。高通量多功能微板测试系统Biotrak-2英国Amersham。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　黑素细胞与角质形成细胞的混合培养模型的建立：鼠尾胶原溶液的制备参照文献。以KGM－G7F培养液(DMEM/F12(3:1)，10％(v/v)胎牛血清，腺嘌呤0.18mM，EGF10ng/ml，氢化可的松0.4μg/ml，胰岛素5μg/ml，异丙肾上腺素10μM，转铁蛋白5μg/ml，三碘甲状腺原氨酸2nM，氨苄青霉素100μg/ml，硫酸链霉素100μg/ml培养角质形成细胞；收集真皮，剪碎，采用组织块法培养以获得成纤维细胞。向生长接近80％融合的成纤维细胞中加入丝裂霉素，最终浓度为10μg/ml，在孵箱中孵育4h，用无钙镁PBS洗2次，加入0.25％的胰酶消化、离心、重悬后计数，以1.0×104/ml接种于已预铺胶原的24孔培养板内，培养液为DMEM+15％小牛血清，隔日使用。
　　取生长状态良好的黑素细胞和角质形成细胞，常规消化、离心，细胞记数后以KGM－G7F培养液重悬，将两种细胞悬液混合，调整角质形成细胞浓度为1.0×105/ml、黑素细胞浓度为0.3×105/ml。将24孔培养板中的培养液吸弃，每孔加入细胞悬液1ml，于50ml/L CO237℃孵箱内培养，每2天换液一次，同时倒置显微镜下观察细胞接种后的生长状况。
　　
　　1．2．2　药物处理与实验分组：药物溶液根据根据文献的方法方法配制实验药物分为芦荟苦素、熊果苷、茶多酚共三大组，对照组以PEH代替，吸弃上清液，每孔加入KGM－G7F 900μl及药物溶液100μl每组药物最终浓度分别为1，0.1，0.01 g/L，每一浓度6个孔。对照组每孔加KGM－G7F 900μl和100μl100ml/L PEH共6个孔。
　　1．2．3　酪氨酸酶活性测定：参见文献的方法。酪氨酸酶活性抑制率=(1－各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100％。
　　1．2．4　黑素含量测定：黑素含量采用NaOH方法测定：药物作用一周后，三种药物各浓度及对照组均取3孔，弃上清液，0.01mol/L的PBS洗2次，每孔加入1ml 1mol/L的NaOH，震荡5 min，每孔中的原液吸取200μl分别加入96孔板的两孔之中，选择405nm波长在高通量多功能微板测试系统上测吸光度值。黑素合成抑制率=[(对照组吸光度值－药物组吸光度值)÷对照组吸光度值]×100％。
　　1．2．5　统计分析：所测数据采用SPSS11.0，NoSA2.3统计软件进行方差分析处理。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　黑素细胞与角质形成细胞混合培养：黑素细胞与角质形成细胞混合培养后，在培养的过程中逐渐出现颜色变化，培养的第五天培养板中的培养物逐渐变成浅灰色，随着培养时间的延长，颜色逐渐加深。
　　
　　2．2　黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：芦荟苦素对酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制；熊果苷对酪氨酸酶活性也呈浓度依赖性抑制，但抑制作用弱于芦荟苦素；茶多酚在各浓度都有非常强的抑制作用，抑制作用强于芦荟苦素和熊果苷(P＜0.05)。表1。

　　
　　2．3　对黑素细胞黑素合成的影响：芦荟苦素、熊果苷及茶多酚对黑素合成有抑制作用，以茶多酚的抑制作用最强，芦荟苦素次之(P＜0.05)；在实验浓度范围内，浓度越高，抑制作用越强。表2。

　　
　　3　讨论
　　
　　自1982年Eisinger和Marko体外培养皮肤MC成功以来，人们对退色剂的研究进入了快速发展的阶段。然而这种黑素细胞的单独培养未考虑体内其它邻近细胞对黑素细胞的影响，并且培养的黑素细胞的生物学行为很大程度上依赖于一系列细胞因子的作用，与体内环境有很大的差异，使得试验结果的参考价值受到一定的限制。1988年Halaban首次成功地建立黑素细胞和角质形成细胞在MCDB－153、DMEM、TIP三种培养基中的共培养，发现MC与KC能在MCDB－153培养基中存活超过14天，Mc的树突延伸至相邻的KC；而MC单独培养于MCDB－153时不能贴壁，7天后失去活性。这说明混合培养降低了对培养基的要求，细胞间的相互接触以及分泌的细胞因子维持了细胞的生长。Valyi－Nagy等将MC和KC共培养于不同的情况下：①MC和KC用微孔多聚碳酸酯膜隔开；②单层细胞混合培养。结果，在第一种情况下，MC的树突保持双极和三级，在KC培养基中不能增值；当MC和未分化的KC建立细胞间连接后，MC和KC以相似的速度分裂增值，并发展为多级的树突状，直接接触的混合培养方式中黑素细胞的形态较间接接触的细胞形态接近在体内的形态。这说明直接接触的混合培养方式更有利于体外对黑素细胞的研究。
　　在培养的过程中，24孔培养板中的培养物逐渐呈现浅灰色，颜色逐渐加深。这表明混合培养的过程中黑素细胞与角质形成细胞相互刺激，促进了黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。在培养的第三天加入退色剂，此时黑素细胞与角质形成细胞刚刚建立接触，尚未发生黑素小体的大规模移行，对实验药物的检测比较灵敏。本试验加入退色剂后的检测结果表明：①芦荟苦素对酪氨酸酶活性呈浓度都依赖性抑制；熊果苷对酪氨酸酶活性也呈浓度依赖性抑制，但抑制作用弱于芦荟苦素；茶多酚在各浓度有非常强的抑制作用，抑制作用强于芦荟苦素和熊果苷(P＜0.05)。②芦荟苦素、熊果苷及茶多酚对黑素合成有抑制作用，在实验浓度范围内，浓度越高，抑制作用越强。三种退色剂对黑素细胞的影响与浓度成正相关，以茶多酚对细胞的影响最大，毒性最强；芦荟苦素次之，与我们前期结果一致。
　　以色素化皮肤类似物为模型来筛选退色剂，虽然黑素细胞所处的环境更接近体内，但由于构建色素化皮肤类似物操作复杂，用于精确筛选某几种退色剂还是比较合适的，用它来大规模地筛选退色剂则受到了一定程度的限制。而黑素细胞与角质形成细胞混合培养模型的构建所需时间短，操作相对简单，又考虑了对黑素细胞有重要影响的角质形成细胞的作用，能够在一个类似生理环境的系统中研究MC和KC的相互作用以及探索退色剂的作用机制，虽然试验结果与临床有一定的差距，但基本上满足了大规模地初步筛选退色剂的要求。在本实验中芦荟苦素所表现出的较好的退色效果，值得我们进一步在色素化皮肤类似物和动物模型中验证和推广，为进一步临床应用奠定基础。