细胞外基质纤维蛋白 微粒软骨脱细胞基质复合纤维蛋白凝胶构建软骨组织工程支架材料的研究

　　[摘要]目的：应用异体微粒软骨脱细胞基质与纤维蛋白凝胶结合作为可注射性支架材料，进行体内构建良好可塑性和生物特性的组织工程化软骨。方法：制备普通家猪耳廓软骨微粒脱细胞基质，与体外扩增的小型实验猪第二代软骨细胞结合，以纤维蛋白凝胶为支架材料，利用其可注射性回植于实验猪自体腹壁外侧皮下，8周后取财进行大体及组织学检测，并与不含微粒脱细胞软骨基质实验组相比较。结果：培养出的组织工程化软骨组织细胞生长良好，具有分泌软骨基质功能，含微粒脱细胞软骨基质实验组表现出更佳的生物学性能。结论：将异体微粒软骨脱细胞基质与纤维蛋白凝胶结合，可以作为良好的可注射性复合支架材料应用于组织工程化软骨的构建。
　　[关键词]微粒软骨脱细胞基质（CMACTM）；脱细胞软骨；纤维蛋白凝胶；可注射性软骨组织工程
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-04
　　
　　The application of allogenic cartilage microparticle acellular tissue matrix with fibrin glue for injectable tissue-engineered cartilage
　　PAN Bai-lin1,LI Jian-ning1,WANG Ping2,HAN Xue-feng3,LI Ming-sen4
　　(1.Department of Plastic Surgery，the Third Hospital of Beijing University,Beijing 100083，China；2. Department of Histology and Embryology, Capital Medical University,BeiJing,100069，China；3.Beijing Chaoyang Hospital of Capital Medical University,BeiJing,100020,China；4.Second People"s Hospital of Taiyuan，Taiyuan 030002,Shanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo establish injectable tissue-engineered cartilage with a new biomaterial which containing allogenic cartilage microparticle accelular tissue matrix(CMACTM) and fibrin glue.MethodsCMACTM from porcine auricle was established and combined with chondrocytes which were taken from the experimental swines and exoteric amplificated.With fibrin glue,the compound was injected back to the abdomen subcutaneously.Specimens were harvested 8 weeks later and analyzed by physics and histology,and also compared with the groups without CMACTM.ResultsChondrocytes in the cultured tissues behaved good functions of growth and secretion, and with better physical charactersin CMACTM groups.ConclusionIt is a promising way of conbining CMACTM and fibrin glue as biomaterial for injectable cartilage tissue engineering.
　　Key words: cartilage microparticle accelular tissue matrix(CMACTM);accelular tissue matrix；fibrin glue；injectable cartilage tissue engineering
　　
　　软骨缺损是临床常见疾病之一。目前，治疗上除了应用自体组织和人工材料修复以外，软骨组织工程逐步成为另一全新途径。软骨组织工程首要面对的两个问题，一是如何获得大量的种子细胞，二是如何选择适当的支架材料。而支架材料当中，可注射性支架材料因其创伤小、可塑性强而逐渐显示出其独特的优越性。然而，通常使用的凝胶类支架材料，促分泌软骨基质成分毕竟有限，而且与固态支架相比，缺乏良好的细胞贴附条件[1]。本实验正是着眼于这一焦点，选取纤维蛋白凝胶（Fg）和微粒软骨脱细胞基质（CMACTM）复合物作为可注射性支架材料，将 CMACTM三维支架的充分贴附性以及纤维蛋白胶的良好可塑性两大优势相结合，再与自体软骨细胞混合后回注动物体内进行在体培养，为构建可注射性组织工程化人工软骨提供一条新的思路。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 材料
　　1.1.1 动物：3月龄实验猪4只(北京大学第三医院动物实验部提供)；附近屠宰场获取新鲜猪耳软骨。
　　1.1.2 试剂：氯化钾分析纯(北京化工厂)，胰蛋白酶（北京均尧伟业生物技术公司），二乙胺四乙酸（EDTA，北京鼎国生物技术有限责任公司），磷酸缓冲盐溶液（PBS），Ⅱ型胶原酶（美国Gibco公司），DMEM/F-12联合培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司），胎牛血清（北京均尧伟业生物技术公司），纤维蛋白胶（哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司），H-E染色试剂（北京鼎国生物技术有限责任公司），Mallory染色剂（Sigma公司），甲苯胺蓝染色剂（北京索莱宝科技有限公司），Ⅱ型胶原鼠抗猪单克隆抗体（美国Rockland抗体公司），免疫荧光标记试剂（美国Rockland抗体公司）。
　　1.1.3 仪器：组织粉碎机（珠海北美电器有限公司），冷冻干燥机（日本Yamato科学株式会社），超净台，倒置显微镜（Olympus），荧光显微镜（Olympus），37℃ CO2孵箱（美国Forma Scientific 有限公司），恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂），电动振荡器（北京天成利通实验室仪器有限公司）等。
　　1.2 方法
　　1.2.1 CMACTM的制备（参考韩雪峰等[2]的制备方法）：猪耳软骨50g用高速组织粉碎机粉碎，冷冻干燥机冻干、磨碎。150目(筛孔直径0.100mm±0.006mm) 及100目(筛孔直径0.154mm±0.010mm)不锈钢滤网依次过筛。获取直径0.100 ～0.154mm 的微粒软骨。将之置入50 ml离心管中,先后浸入1.5 mol/L KCl作用48h，去离子三蒸水作用48h，以及含有0.25%胰蛋白酶( 1∶250)+ 0.02% EDTA 中37℃水浴振荡20h。标本干燥后环氧乙烷消毒，置入干燥罐中备用。微粒软骨体积与作用溶液体积比均为1∶7。所有步骤均在无菌条件下进行。
　　1.2.2 软骨细胞的获取和体外扩增:3月龄实验猪，全麻状态下无菌手术切取猪耳软骨块约20mm×20mm×1mm，PBS液冲洗后用眼科剪将其剪碎成约0.5mm×0.5mm×0.5mm大小的微粒，放入约5倍体积0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，37℃水浴振荡消化12～16h，离心中止消化，150目不锈钢滤网过滤，滤液1000r/min离心10min，沉淀细胞PBS洗涤后用含20％胎牛血清的DMEM/F-12联合培养基（含维生素C 50μg/ml，双抗100U/ml）制备成细胞悬液，调节细胞浓度约为2×105/ml，接种入75cm2培养瓶中，37℃、5％CO2孵箱中培养，3～4天换液一次，约10天后第一次传代，比例1∶4，传代后生长迅速，约3～4天后第二次传代，比例同样1∶4，再次3～4天后细胞长满瓶底，收集后细胞总数达1.0×108个，用于回植。
　　1.2.3 C＋CMACTM＋Fg，C＋Fg，CMACTM＋Fg复合物的制备:将制备的CMACTM 100mg（干重）放入培养皿中，用含20％胎牛血清的DMEM-F-12培养液5ml于37℃、5％CO2孵箱中浸泡24h，1000r/min离心5min，弃上清，无菌滤纸吸干沉淀物（沉淀1），备用。如前方法获取体外培养1.0×108个软骨细胞，1000r/min离心10min，沉淀细胞备用（沉淀2）。取出凝血酶和纤维蛋白原，快速37℃复温。将0.5ml的凝血酶注入含有沉淀2的1.5ml离心管中，电动振荡器充分混匀，制成细胞混悬液0.5ml，形成溶液A。单用0.5ml的凝血酶，形成溶液B。将0.5ml纤维蛋白原与沉淀1充分混匀，制成CMACTM混悬液，形成溶液C。单用0.5ml纤维蛋白原，形成溶液D。将溶液A与C共同注入一个1.5ml离心管内，充分混和、振荡，制成C＋CMACTM＋Fg复合物；同理将溶液A与溶液D混合，制成C＋Fg复合物；溶液B与溶液C混合，制成CMACTM＋Fg复合物。
　　1.2.4 复合物回注入动物体内:如上方法制备出C＋CMACTM＋Fg，C＋Fg，CMACTM＋Fg复合物的悬液各1ml，分别用3个1ml注射器配以粗针头抽取悬液，在悬液凝固前注射入猪腹外侧壁真皮下，每种悬液分2点注射，每点0.5ml，从而形成C＋CMACTM＋Fg实验组（组1）、C＋Fg实验组（组2）和CMACTM＋Fg单纯材料对照组（组3）。
　　1.2.5 取材与观察：注射后8周取材，行大体观察、H-E染色、Mallory染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫荧光照相。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 CMACTM的观察结果：①大体观察：软骨微粒脱细胞基质呈粉末状，乳白色（图1）；②物理性状：干重密度 0.5827±0.1029g/ml，湿重密度 0.9835±0.0893 g/ml，含水量[（湿重重量－干重重量）／湿重重量]为40.8%；③光镜观察：H-E染色显示微粒周边粗糙不平，胶原纤维交错排列，未见软骨细胞及软骨巢（图2）；Mallory胶原染色显示大量纵横交错的蓝染胶原纤维存在（图3）。
　　2.2 软骨细胞体外扩增：第二代软骨细胞数量级1.0×108 个，光镜下观察细胞未贴壁时成圆形，折光性强，贴壁后初为多角形，后呈长梭形，折光性强，富立体感（图4）。
　　2.3 组织工程化软骨指标检测：CMACTM、软骨细胞和纤维蛋白凝胶混合后复合物呈乳白色粘稠胶状，易凝固（图5），在复合物凝固前注入猪腹外侧壁真皮下，8周后取材。以每从一侧耳朵取材并扩增后回植作为一次实验单元，故先后共进行8次实验，其中一次实验单元因回植操作失当导致新生肋软骨组织未能找到，其余7次均在8周后取材。
　　2.3.1 大体观察：4 周后，实验组1与实验组2均在猪腹壁真皮下接种处扪及明显结节。注射后8周取材,剥离周围软组织,可见形成的不规则块状乳白色的类软骨组织。实验组1标本质地稍韧，略显黄色，有较完整包膜，剖开标本有一定的弹性和硬度；实验组2标本相对较脆，触之松散易碎（图6）；对照组未见明显成形组织块。
　　2.3.2 H-E染色： 8周后C+CMACTM+Fg复合物可见膜样结构包裹，软骨细胞生长旺盛，均匀分布，但较正常软骨组织杂乱，可见软骨陷窝，并有血管形成，纤维蛋白凝胶已降解。C+Fg复合物与之比较，软骨细胞生长密度略低，中心部位分布较稀疏（图7～9）。
　　2.3.3 Mallory胶原染色：C+CMACTM+Fg复合物可见普遍蓝染，证实胶原成分的存在；与C+Fg复合物相比较，存在广泛着色较深区域，呈条索样，分布较杂乱，考虑为CMACTM中的胶原成分（图10～12）。
　　2.3.4 甲苯胺蓝染色：C+CMACTM+Fg复合物均匀染成蓝色，其中CMACTM成分呈现深紫色块状和条索状，提示其中的氨基葡聚糖成分；C+Fg复合物均匀染成蓝色（图13～15）。
　　2.3.5 Ⅱ型胶原免疫荧光：C+CMACTM+Fg以及C+Fg复合物Ⅱ型胶原免疫荧光均表达阳性，证实组织中软骨细胞具有分泌Ⅱ型胶原的功能。
　　
　　
　　2讨论
　　
　　软骨组织工程是当前组织工程研究的热点，其组织结构、细胞成分相对简单，成为组织工程研究的理想对象。软骨组织工程的基本要素由种子细胞、支架材料以及培养系统三部分组成。
　　其中，支架材料一般分为天然材料和人工合成材料，根据其空间结构及性状又可分为可注射性材料和三维支架材料两种。可注射性材料与后者相比较, 其优势在于材料与修复组织之间嵌合好, 塑形容易, 细胞和(或)生长因子能与材料充分均匀混合,且能通过微创方式操作, 治疗简单、安全、有效。另外, 可注射性材料还适合于对细胞施加压力,使之产生应力刺激[3-5]。目前较为广泛应用的可注射性材料主要有藻酸盐、Pluronic、纤维蛋白凝胶、胶原等，各自有其优越点和局限性。随着各种新型材料的提取及研发成功，今后可注射性软骨组织工程逐渐向两种或两种以上的复合材料方向发展[6-7]。
　　纤维蛋白凝胶是其中应用较多的天然可注射材料，它由纤维蛋白单体与凝血酶聚合而成。它可通过释放?转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞黏附、增殖并分泌基质，具有良好的生物相容性，可塑性强，韧性极好。但是它毕竟只是细胞外基质的成分，促分泌软骨基质成分能力有限，因此生成的软骨组织与天然软骨仍有一定的差距[8]。
　　脱细胞软骨基质（ACTM）是天然支架材料中的一种，它经多步骤的脱细胞处理，将组织中的可溶性蛋白及细胞成分被除去，保留胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖结构蛋白等主要成分，为细胞生长及植入体内修复缺损提供了物质基础，已应用于血管、猪心瓣膜软骨等实验研究中[9-11]。但是，由于脱细胞基质比较致密，孔隙率较低，因此细胞只能长到ACTM的表面，并不能深入到基质中间。为改进这一缺点，本实验将ACTM粉碎制备成0.100～0.154mm 的微粒，软骨细胞与之结合后，可以围绕于微粒周边并且紧密相连，解决了细胞只能在脱细胞基质表面生长的局限性。
　　本实验将CMATCTM与纤维蛋白凝胶混合作为可注射性支架材料，基于CMACTM微粒直径较小（0.100～0.154mm），可以通过注射器具；同时选取纤维蛋白凝胶作为溶剂，为细胞与CMACTM贴附提供环境支持，将CMACTM三维支架的充分贴附性以及纤维蛋白胶的良好可塑性两大优势相结合，相互弥补了纤维蛋白胶作为单一细胞外基质的不足以及微粒软骨脱细胞基质不能成块的局限，大大提高了组织工程化软骨的生物性能。
　　本实验的培养系统采取动物体内培养方式，工程化软骨组织可通过动物皮下的组织间液获得营养物质的交换，使中心部位的细胞得到足够的营养支持，减少因中央部位组织量较少而形成的“空巢”现象；同时，通过动物的日常活动，使细胞处于机体提供的动力微环境中生长，从而提高工程化组织的生物学及力学性能[12]。从本实验中获得组织工程化软骨组织的各项指标检测结果上看，中心部位细胞生长良好，未见明显的“空巢”现象，基质中氨基葡聚糖和Ⅱ型胶原成分亦较充足，表明新生类软骨组织已具备一定的成熟程度，且相比之下，含CMACTM组表现出更为接近正常组织的特性。然而，该条件下培养出的类软骨组织与正常组织仍存在着差异，从大体形态以及物理性状上看，即使是CMACTM组，类软骨组织结构仍较松散脆弱，抗拉伸和抗压缩能力尚欠佳；从组织学上反映，细胞分布较杂乱，胶原排列欠规则，决定了其生物力学性能还难以达到支持和保护的作用。可见虽然是动物在体培养，但皮下的环境还不足以培养出足够强度的工程化软骨组织，下一步拟将复合物回植于动物关节软骨受力面，通过关节频繁的压缩与牵拉以及关节滑液的流动，对组织产生充足的剪应力和直接作用力，从而获得组织量更大，生物性能更强的组织工程化软骨。
　　
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　　[收稿日期]2008-02-19[修回日期]2008-05-04
　　编辑/张惠娟