毕业LW行业研究BG合集-磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂探讨

　磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂的探讨

　何英杰 吴思源 邓瑞林

　指导老师：黄青云

　[摘 要] 本研究的目的是探讨传统佐剂磷酸铝与新型免疫佐剂分子IL－18联合应用,提高新城疫F基因疫苗免疫效果及其条件和机理.

　研究方法在原有已构建好的真核表达质粒pcDNA-F和鸡白介素18基因真核表达质粒pcDNAcIL-18的基础上,大量提取质粒pcDNAcIL-18和pcDNA-F,并进行含量测定,加入适量佐剂磷酸铝；分组免疫鸡群,设立注射传统疫苗和仅注射生理盐水对照.各组免疫后以HI试验定期监测血液的NDV抗体水平并进行近期攻毒保护试验.

　试验结果表明：使用磷酸铝佐剂和IL-18联合与新城疫F基因疫苗经2次免疫的鸡群近期攻毒保护率比单用F基因疫苗的22.2％提高到了72.7％,虽然仍比不上传统疫苗弱毒疫苗C30一次免疫88.9％,C30一免＋灭活疫苗二免100％的保护效果,但为NDVF基因疫苗的进一步开发应用研究展现了前景,增强了信心.

　[关键词] 鸡新城疫F基因疫苗 IL-18 磷酸铝

　新城疫是危害养鸡业的A类传染病.1990年美国已注册NDV F基因重组鸡痘病毒活载体苗Vector VAX FP-N[1].我国尚未有自主产权的DNA疫苗.导师黄青云教授指导研究生已成功构建NDV F基因和鸡白细胞介素18（IL-18）基因真核表达载体pcDNA-F与pcDNAcIL-18,经鸡的初步免疫试验获得了相当的免疫效果,但有待提高[1][2].本项目在已有免疫试验基础上,参考国内外最新报告,选用实用的传统佐剂磷酸铝[3－8],探讨其pcDNAcIL-18共同作NDV F基因疫苗佐剂,提高免疫效果的作用及其条件和机理.

　1 实验材料和仪器

　1.1 主要试验材料

　 pcDNA-F,pcDNA-cIL-18（导师提供）；磷酸铝胶；DL15000 DNA marker,lambda DNA Hind III Marker,DL2000 DNA marker（购自广州英韦创津生物科技有限公司）；PEG8000,LiCl,乙酸铵（购自广州精科有限公司）；EDTA ,Tris-Cl,NaOH ,SDS,乙酸钾,冰醋酸,异丙醇（购自广州梓兴有限公司）；NDV抗原,ND阳性血清、ND阴性血清（购自肇庆大华农生物有限公司）； LB肉汤培养基（购自广州市微生物研究所）；

　NDV标准强毒株F48E9 （传染病实验室贺东升副教授提供）；

　solution Ⅰ：1.92g葡萄糖、160mL双蒸水、4mL 0.5mol/L EDTA、5mL 1mol /L Tris-Cl（pH8.0）,加双蒸水定容至200mL,115℃ 20min灭菌,4℃保存；

　solution Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1%（w/v）SDS,现配现用；

　solution Ⅲ：5mol/L 乙酸钾 60mL、11.5mL冰醋酸、28.5mL双蒸水；

　实验用岭南黄鸡130只（购自广东智威畜牧水产有限公司）.

　1.2 主要试验仪器

　电子天平（上海天平仪器厂）、TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、TDL-5000B水平冰冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、TGL-18R冰冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）、恒温水浴振荡器（广州天河精科化波仪器批发部）、JC303-4A电热培养箱（上海嘉程仪器设备厂）、752紫外光册分光光度计（上海第三分析仪器厂）、DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）、HV30000多用电泳仪（北京东方仪器厂）、组织匀浆机（Flucko）、PCR仪（UNO-Ⅱ<Biometra公司>）、琼脂糖凝胶电泳槽(北京科普仪器厂)、紫外分析仪(上海四星生物技术有限公司)、黑马凝胶图象分析仪(珠海黑马医学仪器有限公司)、核酸与蛋白自动检测仪(Eppendorf).

　2 方法

　2.1 重组质粒PcDNA-F和 pcDNAcIL-18的鉴定

　将含pcDNA-F、pcDNAcIL-18的基因工程苗JM109、cos7从－70℃冰箱取出,参照参考文献[1][2]介绍的方法,分别进行培养,提取重组质粒,作PCR和双酶切鉴定.

　2.2 pcDNA-F与pcDNAcIL-18质粒的大量制备及含量测量

　参照《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克,1992）的聚乙二醇沉淀法[9],大量提取、纯化载体,操作如下：

　（1）分别将含有pcDNA-F、pcDNAcIL-18质粒的JM109菌株按1％的浓度接种100mL LB液体培养基（Amp+）中,37℃ 150rpm振摇培养18～20h；

　（2）将菌液离心沉淀,沉淀物重悬于3mLsolutionⅠ中,剧烈震荡混匀,随后加入6mL新鲜配制的solutionⅡ,旋紧管盖,缓慢颠倒离心管数次充分混匀,直至液体变透明、凝胶状,冰浴10min；

　（3）加入预冷的4.5mL solution Ⅲ,混匀,冰浴20min,可见产生大量白色沉淀；

　（4）4℃ 7000rpm离心15min,小心收集上清至另一个离心管中,加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温静置15～20min；

　（5）室温7000rpm离心15min,弃上清,于室温用70％乙醇洗涤沉淀,弃净乙醇,真空泵吸净管壁所有液滴,风干；

　（6）用适量TE（pH 8.0）溶解沉淀,再加入等体积的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,冰浴5min,4℃ 12000rpm离心10min；

　（7）将上清转移到另一新的离心管中,加入等体积异丙醇,充分混匀,室温静置15min,室温12000rpm离心10min,回收核酸沉淀；

　（8）弃上清,将离心管倒置以使最后残留的液滴流尽,于室温下用70％的乙醇洗涤2次,弃净乙醇,真空泵吸干管壁所有液滴,风干；

　（9）用适量含RNA酶（20μg/mL）的TE 溶解沉淀,37℃作用30min；

　（10）加入500μL含13％（w/v）PEG8000的1.6mol/L NaCl,充分混匀,4℃ 12000rpm离心10min；

　（11）弃上清,用400μL TE 溶解核酸沉淀,用酚及酚:氯仿:异戊醇（25：24：1）各抽提一次；

　（12）将水相转移到另一个离心管,加100μL 10mol/L乙酸铵充分混匀,加2.5倍体积无水乙醇冰冻沉淀10～30min,室温12000rpm离心10min；

　（13）以后所有操作转到超净台中进行,回收沉淀,弃去上清,用预冷的70％乙醇洗涤2次,在超净台中风干；

　（14）用适量无菌TE 溶解沉淀,-20℃ 冷冻保存；

　（15）取2μL产物用核酸与蛋白自动检测仪测量质粒DNA的含量和纯度.

　2.3 磷酸铝、pcDNA-F和pcDNAcIL-18组合疫苗备制

　根据提取的pcDNA-F与pcDNAcIL-18含量,分别加入饱和磷酸铝胶,使得每毫升液体中含pcDNA-F和pcDNAcIL-18各1000μg,含磷酸铝500μg,在组织匀浆机上以8000r/min 搅拌6min至充分混匀,-20℃保存,备用.

　2.4 实验鸡分组与免疫

　将1d龄雏鸡严格隔离饲养至7d龄,免疫前,先随机抽取24只测定鸡群的ND母源抗体水平,经检测HI抗体滴度均低于1:4.按表5进行分组与免疫.

　2.5 免疫后HI抗体监测

　2.5.1 待测血清制备

　每组鸡只于免疫后0、1、2、3、4周,随机取5只,心脏采血0.5mL/只,分离血清,56℃ 30min灭活后作HI试验.

　2.5.2 1％鸡红细胞悬液的配制

　 静脉采血非ND免疫成年健康公鸡血2 mL,以含3.8％枸橼酸钠的生理盐水抗凝,用生理盐水稀释抗凝血,2000rpm离心洗涤,去上清液,重复3次.最后稀释成1％红细胞悬液.

　2.5.3 NDV抗原HA滴度检测

　用微量法在U型反应板上按表1进行

　表1 NDV抗原HA试验术式

　孔号

　1

　2

　3

　4

　5

　6

　7

　8

　9

　10

　11

　病毒稀释度

　1：2

　1：4

　1：8

　1：16

　1：32

　1：64

　1:128

　1:256

　1:512

　1:1024

　红细胞对照

　生理盐水

　（μl）

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　抗原

　（μl）

　25→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　25

　→

　弃去25

　1％鸡红细胞液（μl）

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　判定结果

　4+

　4+

　4+

　4+

　4+

　4+

　4+

　3+

　2+

　+

　-

　⑴ 能使50μl 1％的鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释倍数为NDV抗原的HA凝集价.本试验第7孔100％凝集,凝集价为1：128倍.

　⑵ 4个单位的NDV抗原凝集价＝凝集价/4.因此下述HI试验的4个单位的抗原为128/4＝32,即1：32倍稀释.

　2.5.4 免疫鸡血清中ND抗体的HI检验

　用微量法在U型反应板上按表2进行

　表2 ND抗体的HI试验术式

　管号

　1

　2

　3

　4

　5

　6

　7

　8

　9

　阴性

　对照

　阳性

　对照

　空白

　对照

　血清稀释倍数

　2

　4

　8

　16

　32

　64

　128

　256

　512

　/

　/

　/

　 生理盐水（μL）

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　/

　/

　25

　待测血清（μL）

　25→

　25→

　25→

　25→

　25→

　25→

　25→

　25→

　25→

　25

　弃25

　25

　/

　4个单位抗原（μL）

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　1%红细胞液（μL）

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　50

　感作

　20~30℃作用30min,15min后每5min观察一次

　判定结果

　—

　—

　—

　—

　—

　 —

　2+

　3+

　4+

　—

　4+

　注：红细胞凝集现象分别以（＋）多少表示强弱程度：（4＋）为完全凝集,ChBC 片状凝集,均匀布满红孔底,边缘不整齐或折叠.（3＋）、（2＋）、（＋）为不同程度凝集,（－）为不凝集,ChBC沉于管底成小圆形,边缘清晰整齐.凡能使4个凝集单位NDV凝集红细胞的作用完全受到抑制的血清最高稀释倍数,称为凝集抑制价（HI效价）.

　2.6攻毒保护试验

　2.6.1 NDV强毒株F48E9半数致死量(LD50)的测定

　用标准强毒株F48E9接种10d龄鸡胚,37℃培养,收集24－48h死亡鸡胚的尿囊液作10－2～10－7倍稀释,每一稀释度接种4只同批次非免疫鸡,0.2 mL/只,37℃孵育,观察记录各组死亡和存活鸡数,用Reed-Muench方法计算LD50；

　2.6.2 攻毒

　一免组于一免后第28d,二免组于二免后第14d,同时分别每只用NDV F48E930个LD50肌注.攻毒后观察两周,统计死亡鸡数,并作病理剖检.

　3 试验结果

　3.1 pcDNAcIL-18、pcDNA-F质粒PCR与双酶切鉴定结果见图1,图2

　 图1、pcDNAcIL-18质粒PCR与双酶切鉴定

　1. DNA Marker DL2000 2. pcDNAcIL-18 PCR产物

　3. pcDNAcIL-18 Hind Ⅲ、BamHⅠ双酶切产物 4. lambda DNA Hind III Marker

　 图2、pcDNA-F重组质粒PCR与双酶切鉴定

　 1. DNA Marker DL2000 2. pcDNA-F基因PCR产物 3. pcDNA -F Hind Ⅲ单酶切产物

　4. pcDNA-F Hind Ⅲ、BamHⅠ双酶切产物 5. DNA Marker DL15000

　3.2 HI鉴测结果见表3,表4

　表3. 一免各组HI鉴测结果：（㏒2）

　免疫周数

　NDVF

　NDVF

　+磷酸铝

　NDVF+IL-18

　NDVF+IL-18

　+磷酸铝

　传统疫苗（C30）

　生理盐水

　0

　2.125

　2.000

　2.125

　2.000

　2.000

　2.125

　1

　2.500

　2.500

　2.625

　3.000

　5.000

　2.000

　2

　2.725

　3.000

　3.125

　3.500

　6.000

　2.125

　3

　3.000

　3.250

　3.500

　3.725

　6.500

　2.000

　4

　3.000

　3.500

　3.625

　3.875

　6.500

　1.500

　表4. 二免各组HI鉴测结果：（㏒2）

　免疫周数

　NDVF

　NDVF

　+磷酸铝

　NDVF+IL-18

　NDVF+IL-18

　+磷酸铝

　传统疫苗（灭活苗）

　生理盐水

　0

　2.000

　2.000

　2.125

　2.125

　2.000

　2.125

　1

　2.500

　2.625

　2.625

　3.000

　5.125

　2.000

　2

　2.725

　3.000

　3.125

　3.500

　6.125

　2.000

　3

　3.250

　3.250

　3.625

　3.625

　6.500

　2.000

　4

　3.500

　3.725

　3.875

　4.000

　7.000

　1.500

　3.3 NDVF48E9半数致死量（LD50）测定结果

　用Reed-Muench方法计算LD50 为10－3..25.

　3.4 攻毒死亡鸡剖检结果

　 剖检死鸡,其新城疫病变很典型.大部分死鸡鸡冠和肉髯发紫,严重的发黑；口腔内充满黏液,嗉囔内充满硬结饲料或充满气体和液体；泄殖腔充血、出血、坏死、糜烂,带有粪污；打开鸡胃,可见腺胃乳头出血,胃与肌胃交界及腺胃与食道交界处有明显的带状出血,肠管黏膜充血、出血；剪开气管,大部分鸡喉气管黏膜充血、出血；有些心冠沟脂肪出血.

　3.5 近期攻毒保护试验结果检表5

　表5.攻毒免疫保护试验结果

　条件

　疫苗

　试验鸡数

　攻毒死

　亡数

　存活数

　保护率

　一免

　（7d龄）

　二免

　（21d龄）

　对照组

　PcDNA-F

　PcDNA-F+磷酸铝

　PcDNA-F+IL-18

　PcDNA-F+磷酸铝+ IL-18

　PcDNA-F

　PcDNA-F+磷酸铝

　PcDNA-F+IL-18

　PcDNA-F+磷酸铝+ IL-18

　弱毒疫苗C30（7d龄1次）

　C30一免+灭活苗二免

　非免疫组生理盐水（2次）

　9

　9

　10

　10

　12

　11

　12

　11

　9

　12

　10

　7

　6

　7

　6

　8

　5

　6

　3

　1

　0

　10

　2

　3

　3

　4

　4

　6

　6

　8

　8

　12

　0

　2/9(22.2%)

　3/9(33.3%)

　3/10(30.0%)

　4/10(40.0%)

　4/12(33.3%)

　6/11(54.5%)

　6/12(50.0%)

　8/11(72.7%)

　8/9(88.9%)

　12/12(100%)

　0/10(0%)

　注:免疫剂量为PcDNA-F,pcDNAcIL-18（简称IL-18）均每次200 ug/只；磷酸铝每次100 ug/只；弱毒苗1头份／只；ND灭活苗1头份／只；生理盐水每次0.2ｍｌ／只．

　4 结果分析

　4.1 图1、图2显示pcDNAcIL-18、pcDNA-F的PCR与双酶切电泳结果均分别出现大小约600 bp(cIL-18) 及1700bp(F)条带,表明两种重组质粒保存良好,可用.

　4.2各免疫试验组一免或二免后每周检测新城疫HI抗体的曲线图分别见图3和图4

　(周)(周)(Log2)(L

　(周)

　(周)

　(Log2)

　(Log2)

　图3.一免的血清NDV抗体检测情况 图4. 二免的血清NDV抗体检测情况

　注：图中曲线：a为NDVF ,b为 NDVF+磷酸铝 ,c为 NDVF+IL-18,d为 NDVF+IL-18+磷酸铝,e为传统疫苗,f为生理盐水

　从图3、图4可以看出：一免与二免后每周的血清抗体水平高低均依次为传统疫苗组 > pcDNA-F+磷酸铝+ IL-18组 > pcDNA-F+IL-18组 > pcDNA-F+磷酸铝组 > pcDNA-F 组 > 非免疫对照组,这与表5近期攻毒保护试验结果中各组鸡的保护情况相一致.

　4.3表5攻毒免疫保护试验表明：

　①一免与二免各组的免疫保护率高低次序也是传统疫苗组 > pcDNA-F+磷酸铝+ IL-18组 > pcDNA-F+IL-18组 > pcDNA-F+磷酸铝组 > pcDNA-F 组 > 非免疫对照组；

　②磷酸铝佐剂和IL-18联合与新城疫F基因疫苗经过二次免疫鸡的近期攻毒保护率达到8/11（72.7％）,比鸡单用NDVF基因疫苗一免的保护率2/9（22.2％）、二免保护率4/12（33.3％）,分别提高了50.5％和39.4％,虽然仍比不上传统疫苗弱毒疫苗C30一次免疫88.9％,C30＋灭活疫苗二免100％的保护效果,但试验表明新城疫F基因疫苗具有进一步的研究﹑开发及应用价值,也对其他DNA疫苗的开发应用研究具有参考价值.

　5 讨论

　近几年来,随着我国兽医卫生事业的不断发展,在疾病的预防与治疗方面,取得了巨大的进展.许多新型疫苗的研制成功为我国养禽业的不断发展做出了巨大贡献.但是,在临床上仍有许多疾病,诸如鸡新城疫、鸡传染性法氏囊、禽流感等疾病不断发生 [3－8].

　本项目在高科技新型分子疫苗﹑新型分子佐剂与传统疫苗佐剂联合应用方面作了探索.研究中发现,使用传统佐剂磷酸铝和pcDNAcIL-18联合作NDV F基因疫苗佐剂,并经2次免疫,免疫鸡的抗体水平和近期免疫保护率都得到显著的提高,其机理可能是磷酸铝具有保护新城疫F基因重组质粒和pcDNAcIL-18重组质粒,使其不会很快被降解,表达时间可以持续延长,而持续表达的pcDNAcIL-18则持续起分子佐剂的作用,因此提高抗体水平及免疫保护效果.

　本项研究结果启示,若继续选用更适宜的常规佐剂、进一步试验pcDNA-F和pcDNAcIL-18的免疫剂量及联合免疫程序等,可继续提高NDV F基因疫苗的免疫效果,直至达到真正能在生产中应用推广.

　致 谢

　本项目是在导师黄青云教授的悉心指导和深切关怀下完成的.一年来,在本项目的研究试验和论文撰写过程中,我们得到导师的孜孜不倦的指导和关心,其谆谆教诲使我们不断的进步和成长、严谨敬业的奋斗精神将使我们受益终生.在此,谨向黄青云老师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！

　与此同时,本项目还得到了兽医学院微生物教研室各位老师、研究生尹会方、王继文、何辉师兄等的大力支持和指导,本科生梁瑞玲、刘晓飞、邓国祥同学的热心帮助,在此表示衷心的感谢！

　本项研究得到了广东省自然科学基金项目(3227)及华南农业大学大学生科技创新活动项目的经费资助！

　主要参考文献：

　【1】. 谢安新.新城疫病毒F基因疫苗与鸡IL-18基因联合免役的探讨[D].广州：华南农业大学.2004.1-53

　【2】. 温纳相.白介素-18的基因克隆﹑表达及生物学作用研究[D].广州：华南农业大学,2003.97-107

　【3】. Kwissa M, Lindblad EB, Schirmbeck R. etal. Codelivery of a DNA vaccine and protein vaccine with aluminum phosphate stimulates a potent and multivalent immune response [j] .J Mol Med , 2003 ,81:502

　【4】. 梁增伟、任红、兰英华、李用国,磷酸铝对乙型肝炎DNA疫苗抗体应答的增强作用[J].中华肝脏病杂志.2004年2月第12卷第2期.79-81

　【5】. 吴艳涛,刘秀楚.新城疫基因工程疫苗研究[J].中国兽药杂志.2001.35（4）：36-39

　【6】. 靳彦文,马清钓.乙型肝炎尖病毒DNA疫苗的研究进展[J].生物技术通讯.2004.15（4）：399-404

　【7】. 姜平主编,兽医生物制品学第二版[M],中国农业出版社.2003.52－56

　【8】. 王世若,王兴龙,韩文瑜等.现代动物免疫学[M].长春：吉林科学技术出版社,2001.155-162

　【9】. 金冬雁、黎孟枫等译,分子克隆实验指南第二版[M],科学出版社.1996.24－28