实验六 新城疫实验室诊断

　 实验六 新城疫的实验室诊断

　　 （一）实验目的

　 1．掌握鸡新城疫的临诊诊断要点。

　 2．掌握鸡胚接种、病毒分离方法并用HA、HI试验鉴定其病毒

　　 （二）实验原理

　 有些病毒，如禽流感病毒、新城疫病毒、Eds76等，能凝集某种动物的红血球，故可以来推测材料中有无该病毒的存在。如有能凝集血球的病毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制还有特异性，故病毒的血球凝集抑制试验，可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体，也可用已知血清来鉴定未知病毒。

　　 （三）实验准备

　 抗凝剂的制备：5%枸椽酸钠+0.9%生理盐水，分装、纱布扎口、灭菌消毒15磅/20min。

　 1％红细胞悬液制备：采集无禽流感和新城疫等抗体的健康成年公鸡的血液与1／4体积的抗凝剂混合，用PH7.2、0.01mol／LPBS液洗涤3次，每次均以3000rpm离心10min，洗涤后用PBS配成体积分数为1％红细胞悬液，4℃保存备用。

　 用具：96孔V型微量反应板、微量移液器(配有滴头)、0.9%的生理盐水。

　　 （四）实验步骤

　 1、鸡新城疫的临诊诊断要点

　 由新城疫病毒(NDV)引起的临诊症状依宿主和病毒毒力两方面的因素而定。在鸡不同的毒株引起疾病的严重程度不同，有的造成急性死亡，死亡率可高达100％，有的仅表现为亚临床型。、不同的宿主感染同一毒株的后果也不同。例如某些毒株可引起鸡和火鸡发生严重疾病，但它们在鸭和鹅仅引起隐性感染。此外，我国的商业鸡群绝大多数为新城疫(ND)的免疫鸡群，发生ND流行主要是由于各种原因造成群体对ND的免疫保护水平下降或免疫失败所致，在临诊症状上大多不典型。与NDV有关的临诊症状有：呼吸困难、腹泻、产蛋下降或停止、精神抑郁、神经症状和死亡。这些症状在有的病例可全部出现，但大多数病例仅部分出现。对不同的鸡群来说，出现临诊症状的鸡所占的比例及发病鸡的严重程度可能有很大差异。典型ND的特征性病变是全身呈出血性败血变化：腺胃乳头出血或溃疡；肠道，特别是盲肠扁桃体和直肠一泄殖腔粘膜呈条纹状出血，间有纤维素性坏死点；腺胃和肌胃的浆膜以及全身脂肪组织多见针尖样出血点。非典型ND的出血性变化大多不明显，剖检时需仔细辨认，盲肠扁桃体和直肠一泄殖腔粘膜出血变化发生的频率通常较高。

　这里必须指出，ND的临诊症状，无论是消化道、呼吸道或神经系统，都不是ND所特有的。因此，ND的临诊诊断只能是初步的诊断。ND的确诊还需进一步进行流行病学调查，血清学试验等综合判定。但最后确诊需要对感染鸡进行病原分离、鉴定。

　 2、鸡新城疫病毒的分离

　 （1）接种材料：无菌取病死鸡病料（脑、肝、脾、喉气管）1g左右放入研磨器内，加入3-5ml生理盐水，研磨后倒入离心管内，加入新大雾头0.1ml（总浓度800单位/ml）；置水溶箱37℃/30min，离心后取上清，作为接种材料。

　 （2）鸡胚接种：尿囊腔接种9-11日龄非免胚0.1~0.2ml/胚，醋封后继续卵乳化24/ml，开始照蛋每日两次，连续5日，弃去24h内死胚，收集24~ 120h死胚和剩余活胚置4℃保持，鸡胚液（尿素液和羊水） 置好在24h内收集，作HA、HI试验，进行病毒鉴定用。

　 3、鸡新城疫病毒的鉴定

　血凝（HA）试验 单位：ml

　孔号

　1

　2

　3

　4

　5

　6

　7

　8

　9

　10

　11

　12

　稀释度

　1∶2

　1∶22

　1∶23

　1∶24

　1∶25

　1∶26

　1∶27

　1∶28

　1∶29

　1∶210

　1∶211

　1∶212

　生理盐水

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　鸡胚液

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　/

　红血球（1%）

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　振荡混匀37℃作用15min观察结果

　结果举例

　++++

　++++

　++++

　++++

　++++

　++++

　+++

　++

　+

　―

　―

　―

　++++ 为完全凝集；+++和++为不完全凝集；一为不凝集。

　凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度，如表所示，病毒滴度为1：26。用于下述血凝抑制试验的病毒需含4个血凝单位，即将一个血凝单位的稀释度增加4倍浓度，例如，一个血凝单位为1：26，4个血凝单位则为1：24。

　HA试验完成后，确定4个HA单位的抗原，进行HI试验。

　血凝抑制（HI试验） 单位：ml

　孔号

　1

　2

　3

　4

　5

　6

　7

　8

　9

　10

　11

　12

　稀释度

　1∶2

　1∶22

　1∶23

　1∶24

　1∶25

　1∶26

　1∶27

　1∶28

　1∶29

　1∶210

　1∶211

　1∶212

　生理盐水

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　标准血清

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　/

　25

　鸡胚液

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　振荡感作：37℃? 10min

　红血球

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　25

　振荡混匀37℃或常温作用15min观察结果

　++++ 为完全凝集；+++和++为不完全凝集；一为不凝集。

　　 （五）结果分析

　 血凝抑制试验结果判定 在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的HI滴度（如图例HI试验）HI价为1:26，一般写作6lg2，证明该病鸡中含有ND病毒（因为其标准血清为ND标准）。血清鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。鸡群HI滴度离散度较小时，而HI滴度较高，其保护水平也高。HI滴度在4lg。的鸡群保护率约为50％；在4lgz以下的非免疫鸡群约为10％，免疫鸡群约为40％；HI滴度在6～10lgz的鸡群保护率达90％～100％。若鸡群有10％左右鸡出现111g。或ll以上的HI滴度，说明鸡群已发生新城疫强毒的感染。

　　 （六）注意事项

　 1、NDV中含有HN→神经氨球酶→解凝作用可与红血球发生凝集作用，但时间过长，又发生解凝作用，在时间把握上很重要，解凝后，红CELL受体被破坏，就不能再凝了

　 2、一个血凝价（HA）含有一个单位病毒，需4个单位病毒，即用：2-7×4=2-7×22=2-5也就是向前推两孔，国际标准需用4单位病毒。

　　 （七）思考题

　 1．免疫鸡群发生新城疫流行时有何特点?

　 2．简述确诊新城疫的实验室诊断程序。