牙周膜成纤维细胞【TGF-β1影响人牙周膜成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶-1的初步研究】

　　[摘要]目的:研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在体外对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)分泌基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)的影响,进而探讨TGF-β1对HPDLFs分泌MMP-1的调控作用,以期为通过生物学途径建立防治正畸过程中牙根吸收的有效方法提供理论依据。方法:原代培养HPDLFs,取传代至第5代HPDLFs实验。设立TGF-β1工作浓度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml;0ng/ml TGF-β1为空白对照组;选取4h、8h、12h、24h、48h 5个时间点收获上清液。双抗体夹心酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked-immunosorbent serologic assay,ELISA)法检测各样本中MMP-1含量。采用多元线性回归方法分析实验结果。结果:MMP-1分泌量与TGF-β1作用时间总体上存在时间依赖性,具有统计学差异,P98%;③人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)酶联检测试剂盒(ELISA Kit)购自北京中杉金桥生物技术有限公司(预包被)。
　　1.2 实验方法:
　　1.2.1细胞培养:原代培养HPDLFs,取14岁男性青少年因正畸治疗需要拔除的双侧下颌第一前磨牙。拔牙术前拍摄根尖X线片并进行详尽的牙周检查,确定该患者双侧下颌第一前磨牙发育完好,牙周组织健康。术后用PBS反复冲洗牙齿,刮取根中1/3处的牙周膜组织,眼科剪剪碎,至0.5～1mm大小,后用10%胎牛血清αMEM培养液冲洗已剥离组织3次;为使HPDLFs顺利从组织块中爬出,使用胶原酶消化20min,4×镜下观察见组织块形态松散,终止消化,离心移去上清;提取组织,置于6孔板中,玻片加压,加入适量10%胎牛血清αMEM培养液,后移至37℃、5%CO2孵箱培养。每隔24h镜下观察细胞生长情况。当细胞自组织块边缘游出,成片生长至6孔板底面积80%时,进行传代培养,每48h给细胞换液,取第5代细胞进行实验。
　　1.2.2各实验组及对照组细胞上清样本收集:根据所购生物因子TGF-β1说明书指示,设立TGF-β1工作浓度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml,即为4个实验组;采用0ng/ml TGF-β1为对照组。取传代至第5代HPDLFs,消化重悬,接种于小方瓶中。将加有上述各浓度TGF-β1 10%胎牛血清αMEM培养液分别加至小方瓶,每瓶4ml,放入37℃、5%CO2孵箱培养。分别于细胞培养至4h、8h、12h、24h、48h各时间点收获上清液,每组取200μl,后立即置入-20℃低温冰箱冻存。
　　1.2.3双抗体夹心ABC-ELISA法检测MMP-1含量:通过双抗体夹心ABC-ELISA法检测各样本上清中MMP-1含量。根据试剂盒说明书指示:抗人MMP-1单抗已包被于酶标板上(48孔 预包被);将ELISA检测试剂盒中的标准品分别加入酶标板第1、2列;第2列为复本,以求减小误差;通过倍比稀释标准品建立标准曲线 (孔H1、H2为空白对照)。
　　将各实验组、对照组样本上清液按布孔设计依次添加至酶标板各孔,37℃孵育120min,洗板,滤干;加入一抗工作液,每孔50μl,37℃孵育60min,洗板,滤干;加入酶标抗体工作液,每孔100μl,37℃孵育60min,洗板,滤干;每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应7min;肉眼观察酶标板已有显色反应,每孔加入50μl终止夜终止反应;在492nm处测吸光值。以上各步骤均严格遵照检测试剂盒说明书操作。
　　1.2.4数据处理:使用SPSS12.0统计软件包,将所测得MMP-1含量用多元线性回归方法进行统计分析。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 HPDLFs原代培养情况:原代培养细胞从组织块中爬出时间为10～14天。镜下观察见:细胞以组织块为中心,呈放射状排列生长,局部形成生长晕,细胞呈长梭形或多突起星形,胞突细长,胞体丰满,胞质均匀,核圆形或卵圆形,核仁清晰。由细胞形态和组织来源鉴定该细胞确为人牙周膜成纤维细胞。传代后细胞生长旺盛,状态良好,性状稳定。
　　2.2 各实验浓度TGF-β1对HPDLFs分泌MMP-1的影响:结果R2值为0.999,说明此次ELISA检验方法严格遵循操作步骤,结果真实可靠。选取由已建立标准曲线所得方程y= 0.197x2 + 0.775x-0.046。R2=0.999 作为标准方程,用Excel换算出酶标板各孔。
　　经由多元线性回归分析得出,以0.05为检验水准,MMP-1分泌量与所设立TGF-β1作用时间梯度存在线性正相关关系。 线性方程:y=0.003+0.002x P=0.033 　　[2]庄 丽,白玉兴.基质金属蛋白酶在正畸源性牙根吸收中的作用[J].北京口腔医学,2007,15(5):295-297.
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　　[收稿日期]2009-11-20 [修回日期]2010-01-25
　　编辑/何志斌