【联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经修复兔面神经缺损】 去细胞同种异体神经修复材料

　　[摘要]目的：通过对去细胞同种异体神经处理方法的改进，找出一种修复兔面神经缺损的理想替代材料。方法：取24只兔子，将兔左侧面神经上颊支切断以造成面神经缺损1.0cm的模型，根据修复方法不同，随机分成2组：实验组为联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经修复组，对照组为自体面神倒置修复组，每组12只。术后3个月行大体观察、神经电生理检测、有髓神经纤维计数以及电镜观察，采用SPSS17.0软件包对数据进行t检验，对面神经恢复情况进行综合评价。结果：两组兔子均存活，切口愈合良好，兔面形基本对称；实验组与对照组左侧面神经上颊支传导速度分别为(55.74±10.56)m/s及(61.34±9.72)m/s，差异无显著性(P>0.05）；实验组与对照组移植体远端吻合口邻近4.0mm段有髓神经纤维数量分别为(18173.62±918.38)n/mm2及(18601.21±982.31)n/mm2，差异亦无显著性(P>0.05)；电镜检查结果相似。结论：联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经能满意修复一定长度的面神经缺损，可以作为自体神经的一种有效替代物。
　　[关键词]面神经；去细胞；神经移植；神经缺损；兔
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）02-0260-04
　　
　　Repair of facial nerve defect with freeze-thaw and chemical acellular allogenic nerve in rabbits
　　LIU Guo-dong,ZHANG Rong-ming,CUI Chao,ZHANG Lin
　　(Department of Plastic and Cosmetic Surgery,The First Affiliated Hospital,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,Liaoning,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveThrough improve the preparative method of extracted acelluar nerve allograft,explore an new effective alternative material for the repair of facial nerve defect.MethodsTook 24 rabbits and a 1.0 cm facial nerve gap was made on the left buccal branch of the rabbits. According to different repair methods, the twenty-four rabbits were randomly divided into trial group that repaired facial nerve defect with freeze-thaw and chemical acellular allogenic nerve graft and control group that repaired facial nerve defect with inverted autologous facial nerve. Each group had 12 rabbits. Some examinations of the two groups were done on the 3th month postoperative, including visual observation, neural electrophysiological testing, image analysis of myelinated nerve fibers as well as electron microscope observation. Using t tests to comprehensive evaluation the data of the recovery of facial nerve with SPSS17.0 software package.ResultsTwo groups of rabbits were alive, the incision healed well and the facial shape of rabbits were basic symmetry. In the trial and control groups, the conduction velocity of buccal branch was (55.74 ±10.56)m/s and(61.34 ±9.72)m /s and there was no significant difference in both conditions(P>0.05), the quantity of myelinated nerve fibers that distanced grafts distal anastomotic 4.0mm was (18173.62±918.38)n/mm2 and (18601.21±982.31)n/mm2 and there was no significant difference in both conditions(P>0.05) too. At the same time, the results of the two groups were also generally similar on electron microscope observation of the neighboring distal nerve of nerve graft.ConclusionFreeze-thaw and chemical acellular allogenic nerve allograft can satisfactory repair a certain length of facial nerve defects, and this is an effective substitute for autologous nerve graft in the repair of facial nerve defects.
　　Key words: facial nerve; acellular; neural transplantation; nerve defect; rabbit
　　
　　面神经缺损的修复是临床上的难题，目前自体神经移植为面神经缺损修复的“金标准”[1]，但是供区神经功能损伤和可以缝合的神经长度及直径受限是不可以克服的障碍，而且来源有限。同种异体神经修复则可以克服上述缺点，具有来源充足、各种类型的神经段都可得到等优点，但存在排斥反应。在同种异体神经处理其抗原性的方法上，许多学者做了大量的研究。现已证实同种异体神经的主要抗原成分中雪旺细胞的抗原性最强[2-3]。孟庆刚等[4]认为冷冻能降低雪旺细胞的活性或灭活移植体内大部分雪旺细胞，从而降低其抗原性。近年来，采用化学去细胞法处理同种异体神经能较好的降低反应原性[5]。本实验联合运用冻融法和化学法去细胞处理同种异体神经，并将制备的异体神经桥接面神经缺损，评价其再生效果。以期研制出一种理想的面神经移植替代物。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 主要试剂及仪器：Triton X-200、 sulfobetaine-10(SB-10)、sulfobetaine-16(SB-16)购自Sigma公司；BL-420F生物机能实验系统（泰盟科技有限公司）；JEM-1200EX透着电镜（日本电子公司）
　　1.2 实验动物及分组：实验动物为24只新西兰大耳白兔（辽宁医学院动物实验中心提供），雄性，体重：2.0～2.4kg。实验前观察确认兔唇活动正常，无面瘫表现，单笼喂养。将24只兔子随机分成实验组和对照组，每组12只，实验组为联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经修复组，对照组为自体面神经倒置修复组。
　　1.3 供体取材及去细胞移植物的制备
　　1.3.1 供体取材：另取12只新西兰大耳白兔，每只兔子称重后，按0.2～0.3ml/kg肌肉注射速眠新行全身麻醉，麻醉后于左下肢作纵向切口，暴露并分离腓神经，切取长约2.0～3.0cm的神经，去除腓神经表面脂肪结缔组织，冲洗后低温保存。
　　1.3.2 去细胞移植物的制备：将所取的12根神经放入液氮中2min，随即取出在37℃恒温水浴中快速2min，重复前步骤3次，随后置于0.05mol/L PBS液体冲洗15min，放入含125mmol/L SB-10的0.01mol/L PBS液体中振荡萃取15h，再用0.05mol/L PBS液体冲洗15min，放入含0.6mmol/L SB-16，0.14％ Triton X-200的0.01mol/L PBS液体中振荡萃取24h，用0.05mol/L PBS液体冲洗15min，放入含125mmol/L SB-10的0.01mol/L PBS液体中振荡萃取7h，放入含0.6mmol/L SB-16，0.14％ Triton X-200的0.01mol/L PBS液体中振荡萃取15 h，0.05mol/L PBS液反复冲洗后放入4℃无菌0.01mol/L PBS液（pH7.2）暂时保存。
　　1.4 手术方法
　　1.4.1 实验组：将每只兔子称重后，按0.2～0.3ml/kg肌肉注射速眠新行全身麻醉，麻醉后将兔子固定于手术台上，术区备皮、消毒、铺手术洞巾；从左侧外耳道口下向口角做直线切口，仔细剥离咬肌表面的筋膜即可见颊支神经进入腮腺，仔细游离面神经上、下颊支，将上颊支游离出约3.0cm长，于中部切除1.0cm长的神经，制成神经缺损模型；用10-0的无损伤针线将联合冻融法和化学法去细胞处理的同种异体神经与上颊支的神经断端外膜缝合3～4针,逐层缝合切口。手术后庆大霉素喷洒切口预防感染。
　　1.4.2 对照组：将每只兔子称重后，同法将左侧面神经上颊支切取1.0cm，将自体面神经倒置缝合作为对照。手术后庆大霉素喷洒切口预防感染。
　　1.5 观察指标
　　1.5.1 大体观察：术后3个月观察兔子是否存活，切口愈合情况以及功能恢复情况。观察每组兔子胡须摆动以及口角歪斜情况，全麻后切开皮肤及皮下组织，显露每只兔子移植体及其所在神经段，比较各组兔子的移植体外观以及与周围组织的黏连情况。
　　1.5.2 神经电生理检测：全麻后切开皮肤及皮下组织，显露左侧面神经上颊支及其对应肌组织。先在移植体的近脑端安放刺激电极，在对应肌组织处安放记录电极，以方波刺激，记录该神经的诱发电位。再将刺激电极安放在移植体的远脑端，记录电极不变，方波刺激后记录诱发电位。分别计算出各段的神经传导速度。
　　1.5.3 有髓神经纤维计数：全麻后切开皮肤及皮下组织，显露左侧面神经上颊支，分别取移植体远端吻合口邻近4.0mm段神经。放入3%戊二醛溶液中固定20h，1%锇酸中固定2h，乙醇、丙酮依次梯度脱水，EPON812环氧树脂包埋，连续半薄切片，厚度1.0μm，行甲苯胺蓝染色，光镜下观察有髓神经纤维，用图像分析仪对神经轴突数目进行分析。
　　1.5.4 电镜观察：在环氧树脂包埋的基础上，做超薄切片，厚度60nm。经醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液双重染色，在透射电镜下观察神经组织的结构。
　　1.6 统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行统计处理，结果以均数±标准差（x±s）表示，采用成组设计资料两样本均数比较的t检验（P≤0.05差异有统计学意义，P>0.05差异无统计学意义）。
　　
　　2结果
　　2.1 术后一般情况及大体观察：术后3个月各组兔子均成活，切口愈合良好。实验组和对照组兔子面部肌力恢复相似，术侧的胡须摆动恢复明显，术侧的口角歪斜情况也有较大改善。两组移植体以及所在神经段外观正常，两组移植体与周围组织黏连均较轻。
　　2.2 神经电生理检测：经神经电生理检测，在实验组和对照组中，移植物所在神经段均可诱发出动作电位，如图1～2。实验组的神经传导速度平均值为(55.74±10.56)m/s，对照组的神经传导速度平均值为(61.34±9.72)m/s，经成组资料均数t检验，t值为1.35，P>0.05，两组之间的差异无统计学意义，如表1。
　　2.3 有髓神经纤维计数：经甲苯胺蓝切片染色，光镜下观察发现实验组和对照组中再生的神经纤维呈束状分布，束内有大量的有髓神经纤维，如图3～4；经图像检测分析，实验组中神经纤维密度平均值为(18173.62±918.38)n/mm2，对照组中神经纤维密度平均值为(18601.21±982.31)n/mm2。经成组资料均数t检验, t值为1.10, P>0.05，两组之间的差异无统计学意义，如表2。
　　2.4 电镜观察：经透射电镜观察，实验组和对照组中有髓神经纤维髓鞘板层结构清晰度，髓鞘的直径及厚度均无明显差异，如图5～6。
　　
　　3讨论
　　降低排斥反应是同种异体神经作为桥接物修复面神经缺损成功的关键。排斥反应主要是由于移植物的抗原性引起的，面神经中主要的抗原成分是雪旺细胞、髓鞘、神经束膜细胞及巨噬细胞表达供体的抗原，而雪旺细胞是排斥反应的主要目标，这是产生移植免疫的主要原因。当异体的神经与受体的神经缝合后，会发生一个快速的移植神经血管化过程。血管的形成，使相关的免疫细胞侵入移植物中[6]。雪旺细胞上MHCI类抗原的完全表达及MHCⅡ类抗原的不完全表达和血管内皮细胞MHCⅡ类抗原的表达并提呈抗原引起T淋巴细胞介导的免疫反应，发生移植排斥[7]。在降低同种异体神经抗原性的方法上，许多学者做了大量的研究。处理移植物的抗原性的方法有反复冻融法[8]、冷冻干燥法、放射法和化学去细胞法[9]等。反复冻融法虽然能杀死细胞,去除免疫原性,但不能清除细胞碎片,且常常引起基底膜碎裂。放射法虽不会引起组织形态的破坏,同时也能杀死细胞,去除免疫原性,但仍不能清除细胞碎片。化学萃取的去细胞同种异体神经组织内的细胞成分可以较完全地清除，可以减少发生免疫排斥反应的可能性，同时保留能够促进周围神经生长的基底膜成分如层粘连蛋白等[10]。刘金超等[11]发现化学脱细胞同种异体神经移植物桥接周围神经缺损后，对运动神经元胞体的存活具有良好的保护作用。牛宇等[12]发现，化学去细胞异体全面神经修复兔面神经缺损，可恢复面神经的运动及传导功能。Hudson 等[13]探索出优化的去细胞异体神经方案，联合应用两性离子的去污剂在磷酸缓冲液中萃取，经实验得出此方法制备的去细胞异体神经无明显的抗原性，移植后能有效促进受体的神经再生。
　　本实验联合运用冻融法和化学法制备去细胞同种异体神经，其原理是冻融处理后的神经其雪旺细胞和髓鞘己被损害，可降低其免疫原性，并且能保留基底膜完整，再利用较温和的化学去污剂Triton X-200、SB-10、SB-16去除已经崩解的雪旺细胞及其髓鞘，进一步降低同种异体神经的免疫原性。该方法制备的移植物修复兔面神经1.0cm的缺损，结果显示，术后3个月去细胞同种异体神经与周围组织的粘连较轻微,神经连续性良好,近似正常神经外观。神经电生理检测表明,去细胞的同种异体神经传导速度在术后第3个月,虽然其均值要比自体神经的传导速度要慢,但两者之间的差异已无统计学意义。甲苯胺蓝染色观察发现,去细胞神经移植体中央显示有大量的再生神经纤维,神经束内有密集的有髓神经纤维分布，大多数有髓神经纤维已比较成熟,再生神经纤维已基本具备正常周围神经的结构。电镜观察两组有髓神经纤维髓鞘板层结构清晰度，髓鞘直径及厚度亦相似,未见明显的差异。这说明经过联合运用冻融法和化学法去细胞处理的同种异体神经与自体神经一样,是良好的神经缺损桥接修复材料。
　　在本实验研究中证明联合运用冻融法和化学法制备的去细胞同种异体神经具有良好的生物相容性，可以明显地降低同种异体神经的抗原性，没有明显的免疫排斥反应。联合运用冻融法和化学法制备的去细胞同种异体神经理论上能够促进周围神经的生长，可以作为自体神经的一种有效替代物。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Spector JG,Lee P,Derby A. Rabbit facial nerve regeneration in autologous nerve grafts after antecedent injury[J]. Laryngoscope,2000,110(4): 660-667.
　　[2]Jakse N,Payer M,Tangl S,et a1.Influence of low-level laser treatment on bone regeneration and osseointegration of dental implants following sinus augmentation. An experimental study on sheep[J]. Clin Oral Implants Res,2007,18 (4): 517-524.
　　[3]Stein E,Koehn J,Sutter W,et a1. Initial effects of low-level laser therapy on growth and differentiation of human osteoblast-like cells[J]. Wien Klin Wochenschr,2008,120 (3-4): 112-117.
　　[4]孟庆刚,岳琦,马勇胜,等.冷冻法与免疫抑制剂法对鼠异体神经移植影响的比较研究[J].中华现代临床医学杂志,2003,1(8)：673-675．
　　[5]衷鸿宾,卢世璧,侯树勋,等．人类去细胞同种异体神经移植物化学萃取方法的研究[J]．中华外科杂志，2003,41(1)：60-63．
　　[6]Best TJ, Mackinnon SE,Midha R,et a1. Revascularization of peripheral nerve autografts and allografts[J]. Plast Reconstr Surg,1999,104(1):152-160.
　　[7]Berger A, Lassner F. Peripheral nerve aIlografts: survey of present state in an experimental model of the rat[J].Microsurgery,1994,15(11):773-777.
　　[8]Fansa H,Lassner F,Kook PH,et a1. Cryopreservation of peripheral nerve grafts[J]. Muscle Nerve,2000,23(8):1227-1233.
　　[9]Sun MX,Tang JS,Xu WJ. Experimental study on chemical extracted acellular nerve allograft [J].Chin J Orthopaed,2006,26(4): 267-271.
　　[10]Hudson TW,Liu SY,Schmidt CE. Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing[J]. Tissue Eng,2004,10(9-10): 1346-1358.
　　[11]刘金超,林晓萍,佟晓杰,等．脱细胞异体神经基质移植物对脊髓前角运动神经元的保护作用[J]．解剖科学进展,2005,11(3)：206-209．
　　[12]牛宇,胡敏,鄂玲玲,等．去细胞异体面神经移植修复兔面神经缺损的实验研究[J]．中国口腔颌面外科杂志,2008,6(2)：114-118．
　　[13]Hudson TW,Zawko S,Deister C,et a1.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration [J].Tissue Eng,2004,10(11-12):1641 -1651.
　　
　　[收稿日期]2010-10-10[修回日期]2011-01-08
　　编辑/张惠娟