人工唾液浸泡对牙本质粘结界面纳米渗漏的影响:牙本质湿粘结

　　［摘要］目的：探讨含细菌的人工唾液对牙本质粘结界面纳米渗漏的影响。方法：选用全酸蚀粘结剂Prime Bond NT(NT)与正常牙本质粘结，制备微拉伸试件。将试件浸泡于含细菌的人工唾液中，分别在即刻、1周、1月、3月时取出，用扫描电镜(SEM)观察粘结界面银沉积情况，并用NlH图像分析软件量化处理，以界面银沉积面积占断裂界面的百分比来评价纳米渗漏程度。结果：粘结界面在即刻、1周、1月、3月时的银沉积面积百分比分别为10.97±5.14、12.25±4.01、16.49±4.43、21.03±5.65。结论：无论浸泡与否，粘结试件都无法避免纳米渗漏的产生；含细菌的人工唾液浸泡使得粘结系统粘结界面纳米渗漏增加,并且银沉积量随着时间的延长而增大。
　　［关键词］人工唾液浸泡；牙本质粘结界面；纳米渗漏
　　[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）06-0867-03
　　
　　Effects of artificial saliva with bacteria on nanoleakage within resin－dentin interfaces
　　WANG Jun-cheng1,HAN Shu-feng1,SU Dong-hua1,ZHAO Xin-yi2
　　(1. Department of Stomatological,The General Hospital of The People"s Liberation Army,Beijing,100853,China;2.Stomatological College, The Fourth Military Medical University)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo evaluate the effects of artificial saliva with bacteria storage on the nanoleakage within resin-dentin interfaces.Methods Prime Bond NT(NT) was bonded with the normal dentin. Matchstick-shaped samples through the bond interfaces were sectioned and immersed in artifical saliva with bacteria. Theresin-dentin interfaces of the the specimens were studied with scanning transmission electron microscopy(SEM) to identify the amount and distribution of silver uptake at 0 day,1 week,1 month and 3 month respectively.They were then subjected to image analysis by NIH Image PC. Leakage scores of each restoration were calculated as the percentage of the total area of the broken interface that was penetrated by silver nitrate. Results The ratios of the silver leakage of the resin-dentin interfaces at 0 day,1 week,1 month and 3 month was 10.97±5.14,12.25±4.01,16.49±4.43 and 21.03±5.65 respectively.ConclusionAII the bonding samples in this study could not resist nanoleakage. After storage in artificial saliva with bacteria, the ratios of the silver leakage within resin-dentin interfaces showed the trend of increase. And the amount of silver would increase as the storage time went on.
　　Key words:artificial saliva storage; resin－dentin interfaces; nanoleakage
　　
　　自1994年Sano［1］提出纳米渗漏的概念以来，有关牙本质粘结界面纳米渗漏的研究日益增多，并逐渐成为继微渗漏后粘结剂边缘封闭研究的热点。被粘结后的修复体在口内要始终处于唾液的包围之中，因此，唾液及其口腔内的细菌无疑会对粘结后修复体的长期稳定性产生一定的影响。在唾液及其中的细菌的作用下，牙本质粘结界面的微观结构会发生怎样的变化，目前有关这方面的研究还相对较少。本实验采用人工唾液，并在其中加入口腔内的常见细菌来模仿口腔内的液体环境，研究唾液及其中的细菌对牙本质粘结界面纳米渗漏的影响。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 材料：新鲜拔除的无龋人第三磨牙（拔除后1个月，贮存于4℃生理盐水中）；复合树脂：Chrisma (Kulzer, Germany)(A2色) 批号：052；酸蚀剂：GLUMA Etch Gel(35%磷酸)(Heraeus Kulzer,Germany) 批号：480；粘结剂：Prime Bond NT(Dentsply, USA)；50%氨化硝酸银溶液（pH=9.5）：25g硝酸银（分析纯）溶于25g蒸馏水中，滴入28%氨水至溶液重新变澄清为止。EDTA二钠盐(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；显影粉(米吐尔,无水亚硫酸钠)。
　　1.2 设备：EZ-TEST500N微拉伸试验机（SHIMADZU,Japan）；光固化机：SpectrumTM 800 curing unit (Dentsply,USA)；150低速金刚锯（中国）；扫描电镜（JSM-6460,Japan）。
　　1.3 含细菌人工唾液的配置：选择ATCC15987粘性放线菌、ATCC25175 变型链球菌、细菌室的乳酸杆菌作为口腔常见细菌的代表。菌种经纯化后，用麦氏比浊管配制成1×109/ml,待用。在无菌试管中加入含有培养基的人工唾液3ml（具体成分见表1），每种细菌加0.1ml,混匀。放入37℃厌氧环境培养（N2 ：80%、H2：10%、CO2：10%）,每3天更换一次。（如图1）
　　
　　1.3 试件的制备：选用8个新鲜拔除的人无龋磨牙，用实验切割机在流水下垂直于牙体长轴去除牙合面釉质，暴露中层牙本质，经体视显微镜观察无釉质残留后磨平牙本质以形成粘结面，600目碳化硅水砂纸打磨后准备粘结[2]。将准备好的牙按照说明书的要求和步骤使用Prime Bond NT粘结，然后用复合树脂修复，形成高为4mm的树脂冠。5min后将粘结好的牙齿贮存于37℃蒸馏水中。24h后，流水冲洗下用低速锯沿近远中向和颊舌向，垂直于界面将牙齿切割成0.9mm×0.9mm×8mm的条形试件（如图1）。每个牙齿取6～8个试件，把试件放入无菌试管内，加75%乙醇消毒30min，取出用无菌蒸馏水清洗3次，待用。
　　1.4试件的人工唾液浸泡及界面观察
　　1.4.1硝酸银染色：首先取出10个试件，试件干燥后，除了粘结界面0.5mm以外，涂两层指甲油，指甲油干后浸于50%氨化硝酸银溶液避光保存12h，蒸馏水冲洗后再浸于显影液中荧光照射8h。然后其余试件分别于1周、1月、3月时分别取出进行染色。
　　1.4.2 SEM观察断面银渗漏程度：用502胶（哈尔滨同林胶粘剂厂）将实验试件的牙本质端和树脂端固定于特制的试件夹持固定装置上，通过夹具连接到万能材料试验机上(传感器500N,预载荷5N)，进行拉伸,速度为1mm/min。将试件牙本质和树脂断端干燥、喷金，用扫描电镜（SEM）观察断面的银渗漏程度，用NIH图像分析软件(Scion, Fredrick, MD,USA)统计界面银渗漏面积占断裂界面的百分比，用SPSS软件对测试结果进行统计分析。
　　
　　2结果
　　
　　粘结试件随唾液浸泡时间在SEM下的电镜照片如图2。电镜（SEM）下，银渗漏形态有网状，树枝状和斑点状，随着浸泡时间的延长，还有连成片状的银沉淀，主要集中在混合层。SEM观察唾液浸泡前后粘结试件的银渗漏面积见表2。唾液浸泡前后,都可以观察到纳米渗漏的存在。唾液浸泡3个月后，试件的银渗漏面积百分比较浸泡前明显增大(P＜0.05)，而在1周、1月时试件的银渗漏面积却未发生显著性变化(P＞0.05)。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　1994年，Sano[1]等用电子显微镜发现混合层中有特殊物质渗入，甚至在无边缘裂隙形成的情况下都可能发生。为使之与微渗漏区分，1995年他提出了纳米渗漏的概念。由于纳米渗漏的存在，可能使得水、细菌产物等小分子进入粘结界面产生破坏作用，并且，随着水分及细菌代谢产物的进入，可能会加速粘结界面的老化破坏，从而对粘结的长期效果产生影响。因此纳米渗漏成为研究粘结剂边缘封闭的热点。
　　对于纳米渗漏的评价，已经从早期的定性研究向定量研究发展，Li等［3］用银颗粒占粘结界面长度百分比度量纳米渗漏程度，Okuda等 ［4］用NIH图像分析软件检测银沉积面积来研究纳米渗漏与粘结强度的关系。国内康彪等［5］将TEM图像扫描后用NIH图像分析软件计算银沉积(纳米渗漏)在混合层中所占面积百分比来评价纳米渗漏程度。但是操作过程较复杂，技术敏感性高，对实验结果有很大影响。扫描电镜（SEM）要求样品厚度一般从几毫米到数厘米，且操作相对简单，且SEM在背散射电子模式下观察银渗漏，能获得更为清晰的图像。因此本实验选用SEM观察断面。
　　关于纳米渗漏形成的机制，目前认为全酸蚀粘结系统需要单独使用酸蚀剂处理牙本质表面，酸蚀处理可以使玷污层下产生程度逐步递减的数微米牙本质脱矿层,而目前的全酸蚀粘结剂由于不能完全封闭牙本质脱矿层,从而在混合层和正常牙本质基质之间遗留有一层直径约10～50nm多孔性的部分脱矿牙本质结构，这种酸蚀后脱矿的深度与树脂渗透的深度不一致而导致了纳米渗漏的存在。本实验正是在这些部位观察到银离子的大量聚集，验证了这一结论。并且，在本实验中无论浸泡人工唾液与否，所有粘结系统粘结界面都有纳米渗漏产生，表明粘结系统自身性质或操作因素决定了纳米渗漏的产生和特征。纳米渗漏可成为粘结界面物质交换的场所，水分以及细菌代谢产物可籍此作用于牙本质，进而刺激牙髓，可能成为术后继发症状的原因之一。
　　这种虽然在界面没有明显裂隙存在却有能够让小分子通过的纳米渗漏的存在，使得水能自由通过混合层，水的存在会使得混合层随着时间产生老化破坏。通常在混合层中存在两种降解方式：暴露的胶原纤维的降解和胶原纤维网中树脂的降解。对于全酸蚀粘结剂而言，由于树脂单体在酸蚀牙本质中渗透时浓度梯度的降低，会在混合层底部产生一个不完全渗透区，该区中存在着暴露的胶原纤维[6-8]，并且，随着水分及细菌代谢产物的进入，可能会加速粘结界面的老化破坏，从而对粘结的长期效果产生影响。在本实验中，界面的银沉积量不断的增加，也证明了这一观点。
　　国内学者闫晶等[9]研究发现单纯浸泡人工唾液NT在6个月时银渗漏面积显著增大，本实验由于在人工唾液中加入口腔常见细菌，在细菌及其产物的协同作用下，与单纯浸泡人工唾液相比，银渗漏面积的增大速度加快，3个月即出现显著性变化。说明细菌及其产物对界面的破坏也起了一定作用。但究竟二者之中，谁起主导作用，还有待进一步研究。
　　本实验中，NT采用湿粘结技术，技术敏感性强，水分控制不容易把握，残留水分会与粘结树脂竞争空间导致固化不全[10]。并且，NT属于两步法酸蚀－冲洗粘结系统。有研究表明，不完全的聚合和粘结剂渗透性在简化装粘结剂中更突出，两步法酸蚀－冲洗可能由于高浓度的亲水性单体的存在，粘结界面缺乏非溶媒的疏水性树脂膜，使得水的存在增加，从而增加了水解破坏作用。
　　在SEM在观察银沉积的位置，对于NT来说，多在混合层底部的脱矿牙本质区，这可能正是由于全酸蚀粘结系统酸蚀牙本质后脱矿的深度与树脂渗透的深度不一致而导致纳米渗漏存在所产生的结果。
　　
　　4结论
　　
　　4.1无论浸泡人工唾液与否，粘结试件都无法避免纳米渗漏的产生。
　　4.2 粘结试件随着浸泡时间的延长，出现了粘结界面银渗漏程度增大，表明人工唾液及细菌会影响粘结的稳定性，并且表现出协同作用。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Sano H,Shono T,Takatsu T, et al. Microporous dentin zone beneath resin impregnated layer[J].Oper Dent,1994,19(2):59-64.
　　[2]Dental materials-guidance on testing of adhesion to tooth structure International Organization for Standardization (1994).ISO TR 11405 .
　　[3]Li H,Burrow MF,Tyas MJ. The effect of thermocycling regimens on the nanoleakage of dentin bonding systems[J].Dent Mater，2002,18(3)：l89-96.
　　[4]Okuda M,Pereira PN,Nakajima M,et a1.Relationship between nanoleakage and long-term durability of dentin bonds[J].Oper Dent,2001,26(5):482-490.
　　[5]康 彪，赵信义，唐立辉,等. 冷热循环对牙本质粘结界面纳米渗漏的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2004,14(11):619-622.
　　[6]Hashimoto M,Ohno H,Sano H.In vitro degradation of resin-dentin bonds analyzed by microtensile bond test, scanning and transmission electron microscopy [J].Biomaterials,2003,24:3795-3803.
　　[7]Armstrong SR, Keller JC, Boyer DB. The influence of water storage and C-factor on the dentin-resin composite microtensile bond strength and debond pathway utilizing a filled and unfilled adhesive resin [J]. Dent Mater,2001,17:268-276.
　　[8]Spencer P,Wang Y, Katz JL.Identification of collagen encapsulation at the dentin/adhesive interface [J]. J Adhes Dent,2004,6:91-95.
　　[9]闫 晶，赵信义，施长溪.3种粘结剂对龋损内层牙本质粘结强度的研究[J].实用口腔医学杂志，2006，22(1):87-90.
　　[10]Munck J,Van Landuyt K,Peumans M,et al. A critical review of the durability of adhesion to tooth tissue: methods and results [J].J Dent Res,2005,84:118-132.
　　
　　[收稿日期]2008-04-01[修回日期]2008-04-23
　　编辑/何志斌