成纤维细胞名词解释_血管紧张素Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖的影响

　　目的：探讨血管紧张素Ⅱ及其Ⅰ型受体(AT1)拮抗剂洛沙坦(losartan)对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖的影响。方法：体外分离培养增生性瘢痕戍纤维细胞，在不同浓度的血管紧张素Ⅱ、losartan、PD123319作用下，观察成纤维细胞的生长情况，并绘制生长曲线，采用MTT法和3H－TDR掺入释放法分别检测成纤维细胞增殖和DNA含量的情况。结果：血管紧张素Ⅱ在浓度为10-8Smol/L～10-5mol/L时，成纤维细胞的细胞数量明显增多，DNA含量增加(P＜0.05)；losartan能几乎完全抑制AngⅡ的这种作用，PD123319对此作用几乎没有影响。结论：AngⅡ可促增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，该作用主要通过AngⅡ的Ⅰ型受体介导完成，AT1的拮抗剂有望在增生性瘢痕防治中发挥重要作用。
　　[关键词]血管紧张素Ⅱ；洛沙坦；细胞增殖；增生性瘢痕；成纤维细胞
　　[中图分类号]Q343.6　[文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0298－04
　　
　　增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和胶原蛋白无序沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。血管紧张素Ⅱ(an－giotensin Ⅱ，AngⅡ)作为肾素一血管紧张素系统中重要的因子，通过内分泌、旁分泌和自分泌等方式发挥其多种生物功能。其经典作用是引起血管收缩和调节水盐平衡。目前越来越多的研究结果认为Ang Ⅱ作为一种生长因子，是一种强烈的有丝分裂原，在促进心肌间质、肾脏间质、肺间质以及血管壁纤维化的过程中发挥重要作用。本研究的目的在于观察Ang Ⅱ及其Ⅰ型受体拮抗剂洛沙坦(losartan)对来源于人类增生性瘢痕成纤维细胞的生长和增殖的影响，为探索增生性瘢痕的发生机制及防治方法提供资料。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　主要试剂：Ang Ⅱ、Losartan、PD123319(美国Sigma)；DMEM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Hyclone)；3H－TDR(北京原子能研究所)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，Serva分装)；医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ－875型)；CO2培养箱(美国SHEL－LAB1815TC型)。
　　
　　1．2　取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾使用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗；②病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病；③病人无全身感染、肿瘤；④无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未全身应用皮质类固醇等药物治疗；⑤瘢痕局部症状典型。
　　
　　1．3　实验分组：实验分为四组：①对照组：20％新生小牛血清的DMEM培养液：②Ang Ⅱ组：培养液中加入Ang Ⅱ，浓度范围10％-9mol/L～10-5mol/L；③Ang Ⅱ+losartan组：培养液中先加入lO-9mol/L～10-5mol/L的losartan预处理30min，再加入同浓度AngⅡ；④AngⅡ+PD123319组：培养液中先加入10-9mol/L～10-5mol/L的PD123319预处理30min，再加入同浓度AngⅡ。
　　
　　1．4　成纤维细胞分离、培养：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6～8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3～4天换液1次，2～3周后，原代细胞生长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，此后每2～3天换液1次，每4～5天分种传代1次，实验用第3～5代细胞。
　　
　　1．5　绘制成纤维细胞的生长曲线：取成纤维细胞以5×104个/ml的密度接种于24孔细胞培养板，每孔含有0.5ml的培养液，待其铺满培养板80％时，换成含0.5％小牛血清的DMEM培养液，再分别加入不同浓度的Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan,Ang Ⅱ+PD123319，每一浓度设三个复孔，并设立只加入培养基的对照组。培养24h后用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，分别收集各孔细胞，用PBS洗涤后计数。
　　
　　1．6　Ang Ⅱ和losartan对成纤维细胞增殖的影响：用MTT法测定成纤维细胞的增殖情况，取对数生长期的细胞，细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板。每孔含150μl的培养液，待细胞贴壁后，换成含10％小牛血清的DMEM培养液，再分别加入不同浓度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123319，每一浓度设三个复孔，并设立只加入DMEM培养基的对照组。细胞继续孵育24h后，在已培养细胞的96孔板每孔中加入0.5％MTT 10μl，置于37℃4h后，弃上清，加入100tμl DMSO(二甲基亚砜)震荡15min后，使形成的甲月赞(formazan)充分溶解。然后在酶标仪上测测定波长570nm处的吸光值。
　　
　　1．7　3H～TDR掺入释放法检测成纤维细胞中DNA的含量：将细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板。每孔含150μl的培养液，待细胞贴壁后，换成含无血清的培养液，再分别加入不同浓度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123319，每一浓度设三个复孔，并设立只加入DMEM培养基的对照组。细胞继续孵育24h后，培养结束后弃去培养基，加入胰蛋白酶消化约2mim弃胰蛋白酶加入D―Hank’s液洗涤细胞数次后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上；再经10％三氯醋酸和无水乙醇沉淀、固定后，置于70℃烘箱内烘干；将滤膜放入有闪烁液的液闪杯中测量样本的放射脉冲数(以dpm值表示)。
　　
　　1．8　统计学处理：每组实验重复4次，以SPSS 10.0统计学软件分析。数据以x±s表示，进行t检验、相关分析及多个实验组与同一对照组的比较的方差分析，P＜0.05有统计学意义。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　成纤维细胞的生长情况：当Ang Ⅱ的浓度为10-8～10-5mol/L时，成纤维细胞增殖明显，且与对照 组相比有显著性差异(P＜0.05)。而AngⅡ+losar－tan组中，成纤维细胞的增殖不受Ang Ⅱ的影响，与对照组相比也无显著差异。而Ang Ⅱ+PD123319组与AngⅡ组结果相似，无显著差异。
　　
　　2．2　MTT法测成纤维细胞的增殖：MTT比色法A570nm吸光度值显示：当Ang Ⅱ的浓度为10-8～10-5mol/L时，成纤维细胞增殖明显，且与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。而Ang Ⅱ+losartan组中，成纤维细胞的增殖不受Ang Ⅱ的影响，与对照组相比也无显著差异。Ang Ⅱ+PD123319组与Ang Ⅱ组结果相似，无显著差异。见表1。

　　H3－TDR掺入释放法检测成纤维细胞中DNA的含量变化：以H3－TDR掺入dpm值代表细胞内DNA含量。结果表明，AngⅡ在10-8～10-5mol/L浓度范围内，成纤维细胞的DNA含量明显增多，与对照组有显著差异(P＜0.05)；而Ang Ⅱ+losartan组中，成纤维细胞的增殖不受Ang Ⅱ的影响，与对照组相比也无显著差异。Ang Ⅱ+PD123319组与Ang Ⅱ组结果相似，与AngⅡ组无显著差异。见表2。

　　
　　3　讨论
　　
　　肾素一血管紧张素系统(RAS)是机体调节血管张力和水钠代谢的内分泌系统的组成部分，随血液循环发挥作用。血管紧张素Ⅱ是RAS系统的主要活性成分。目前，以AngⅡ为主要因子的RAS在一些组织器官的纤维化过程中的重要作用正逐渐引起越来越多学者的关注。在纤维化过程中，局部组织的RAS激活，包括AngⅡ在内的一些因子表达水平升高，提示局部RAS可能参与了组织器官纤维化和/或结构重构过程。这样的器官包括肝脏、肾脏、心脏、肺和皮肤。ACE抑制剂、Ang Ⅱ受体拮抗剂和阻断剂等可通过不同方式延缓和/或抑制器官纤维化的发生，进一步说明Ang Ⅱ有促器官纤维化的作用。Ang Ⅱ受体主要分为AT1、AT2两种亚型，AT1受体是一种膜受体，它具有激素受体的所有特征。它介导血管紧张素Ⅱ受体的大部分生理功能。Sun等检测到AT1在心肌纤维母细胞上的表达，Bril－la等通过3H－TDR掺入释放法和胶原酶活性分析法发现，Ang Ⅱ在10-7mol/L时心肌纤维母细胞大量增殖，胶原合成增加。有学者在肾脏间质、肺组织、肝组织中也检测到了AT1受体，研究发现AngⅡ能促进这些器官组织的纤维化。
　　增生性瘢痕是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理表现，其机制目前还不清楚。近年来的研究表明，AngⅡ能促进皮肤成纤维细胞的增殖和细胞外基质的沉积，提示AngⅡ在人类瘢痕形成可能具有独特的作用。刘宏伟等研究发现，在瘢痕形成过程中血管紧张素转化酶和血管紧张素Ⅱ表达增加，提示在瘢痕形成过程中皮肤局部RAS系统的激活，在瘢痕的形成和调控中发挥作用。
　　在本实验中，来源于人增生性瘢痕的成纤维细胞受到浓度高于10-8mol/L的Ang Ⅱ刺激时增殖明显，且与AngⅡ的浓度呈正相关关系，浓度越高增殖越明显。AngⅡ的Ⅰ型受体AT1的拮抗剂losartan能够完全抑制该作用，而Ang Ⅱ的Ⅱ型受体拮抗剂PD123319对此作用没有影响。
　　通过以上结果推测，在增生性瘢痕发生过程中起关键作用的成纤维细胞，在AngⅡ的作用下，通过结合该细胞上的受体AT1，大量激活并增殖，而AT1的拮抗剂losartan通过阻断AT1，减少成纤维细胞的生长增殖。肾素一血管紧张素系统可能参与了瘢痕的形成，对皮肤局部的RAS系统的研究可能在探索瘢痕增生的机制和皮肤创面及瘢痕治疗方面开辟一个新的途径。