小鼠衰老模型_补益营卫对衰老小鼠皮肤组织tPA表达的影响

　　[摘要]目的：通过观察补益营卫对衰老皮肤的影响，探讨补益营卫延缓皮肤衰老的深层次机制。方法：利用D-半乳糖120mg/（kg・d）皮下注射制造小鼠皮肤衰老模型。利用免疫组织化学方法和图像分析系统评价组织型纤溶酶原激活物(tPA)在衰老皮肤中的表达。结果：造模后tPA表达水平明显增加，与各组相比有显著统计学差异（P0.05）。VE可使增加的tPA降低，与模型组相比有统计学意义（P0.05).ConclusionSupplementing Ying-wei can delay skin aging. Supplementing Ying-wei improved ageing skin condition by reduced the tPA aimproved breed.
　　Key words:skin aging;ying-wei;immunohistochemistry; tPA;TCM therapy
　　
　　营卫具有“熏肤、充身、泽毛、温分肉、充皮肤、肥腠理、司开合”的作用，与皮肤生理病理有十分密切的关系。营卫的盛衰是影响皮肤状态的重要因素[1]，因此，研究营卫与皮肤衰老间的关系具有理论和实践意义。本实验拟通过对参与皮肤胶原代谢的组织型纤溶酶原激活物 (tPA)活性的研究以揭示补益营卫在改善衰老皮肤状态中的作用，探讨补益营卫延缓皮肤衰老的深层次机制。
　　
　　1材料和方法
　　1.1实验动物及材料：健康4月龄昆明种小鼠120只，清洁级，雌雄兼用。购自北京大学医学部实验动物中心。各组小鼠在相同条件下，自由摄食、饮水、保持自然光照。
　　补益营卫药物由人参、甘草等组成，药物购自本校国医堂，为同仁堂优质饮片。由本校药学系中药制备教研室加工、浓缩成4g/ml（每毫升含4克生药）的浸膏，避光4℃冷藏备用，灌胃时用生理盐水配成所需浓度。设维生素E为阳性对照药，购自市售药店。
　　1.2分组造模及处理：把120只4月龄昆明种小鼠雌雄分开，每性别小鼠体重均衡随机各分为6组，每组10只，分别设为正常组、模型组、阳性对照组、补益营卫高剂量组、中剂量组和低剂量组。正常组常规进食饮水及光照。其他各组参照文献法[2]按120mg/kg体质量每日背部皮下注射D-半乳糖，每周禁食称重一次。造模同时模型组每日灌服生理盐水，阳性对照组每日灌服维生素E 50mg/kg，补益营卫高、中、低剂量组按（生药/体质量）8g/kg、4g/kg、2g/kg灌胃，连续6周。第7周处死动物前一天，动物用10%硫化钠溶液脱去两肩胛至两髂骨之间背部皮肤的毛，第二日用10%水合氯醛按3.5ml/kg体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取全血放入肝素钠管中，低温离心机3 500rpm，离心20min取上清冷藏待测。剪取颈部皮肤，置4%中性多聚甲醛溶液中固定，1周后换溶液1次。24h后常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。
　　使用仪器：AE160型电子分析天平，DDL-5型低温离心机， Bio-RAD680酶标比色仪，全自动石蜡切片机，Olympus光学显微镜，台式水浴恒温振荡器SHZ-88等。
　　使用试剂：多聚甲醛、无水乙醇等分析纯购自北京化学试剂公司。兔抗鼠tPA多克隆抗体、黄色DAB显色剂、山羊抗兔IgG-抗体-HRP多聚体、牛血清白蛋白（BSA）均购自北京中山金桥生物工程有限公司。复合消化液购自武汉博士德生物工程有限公司。
　　1.3免疫组织化学法检测TPA的表达：5μm石蜡切片脱腊、水化，3%H2O2室温孵育10min，PBS洗3min×3，去离子水洗2min，3%H2O2室温孵育10min，0.01M PBS洗3次，每次3min，滴加复合消化酶，37℃修复20min，0.01M PBS洗3次，每次3min，牛血清白蛋白室温封闭20min倾弃，滴加1∶100兔抗鼠TPA多克隆抗体，4℃过夜，0.01M PBS洗3次，每次5min，滴加山羊抗兔IgG-抗体-HRP多聚体，37℃30min，0.01M PBS洗3次，每次5min，滴加黄色DAB室温显色5min，去离子水洗中止反应，脱水、透明、中性树胶封片。每组染色均设以PBS液代替一抗的阴性对照。必要时去离子水洗中止反应后苏木素衬染，脱水、透明、中性树胶封片。
　　通过安装在B×51正置荧光显微镜上的照相系统以及计算机Image-pro plus 5.1图像分析软件对TPA免疫组织化学显色结果进行拍照和分析。拍照时每剂量组显色组织切片20倍物镜下随机选取18处视野进行拍照存档，测量时用Image-pro plus 5.1图像分析软件以统一的光密度(Density,简称为D)阈值作为测量指标，以光密度值平均值的高低作为衡量各组皮肤TPA蛋白表达的尺度。
　　1.4数据统计：数据资料均采用均数±标准差(x±s)表示，数据进行方差齐性检验后用t检验进行多组均数的两两比较。
　　
　　2结果
　　正常小鼠皮肤tPA在角质层以下表皮细胞弱表达，毛囊上皮细胞、皮脂腺细胞有较强棕黄色颗粒表达，真皮成纤维细胞未观察到表达（见图1A）。模型组小鼠tPA在角质层以下表皮细胞、毛囊上皮细胞、皮脂腺细胞均强表达（见图1B）。给与维生素E后，tPA在角质层以下表皮细胞、毛囊上皮细胞、皮脂腺细胞的表达明显减弱（见图1C）。经补益营卫处理后，tPA在角质层以下表皮细胞、毛囊上皮细胞、皮脂腺细胞的表达也明显减弱（见图1D、E、F）。图像分析显示：造模后tPA表达水平明显增加，与各组相比有显著统计学差异（P0.05）。VE可使增加的tPA降低，与模型组相比有统计学差异（P