富血小板血浆 富含血小板血浆双相接种法构建的组织工程骨修复山羊颅骨缺损

　　[摘要]目的：观察以富含血小板血浆（platelet-rich plasma PRP）介导的双相接种法构建的组织工程骨在体内的成骨是否优于普通双相接种法和传统静滴接种法。方法：用传统静滴法（对照组）和富含血小板血浆（PRP组）、乏血小板血浆（PPP组）双相接种法构建组织工程骨，并用其修复山羊颅骨临界缺损，术后3月通过CT扫描、组织病理学观察三组动物颅骨缺损处成骨情况。 结果：PRP组的成骨量显著较PPP组合和对照组（P0.05）。 结论：用PRP介导的双相接种法构建组织工程骨在体内早期成骨优势显著；PRP双相接种法是安全、简便、实用、高效的细胞接种方法。
　　[关键词]富含血小板血浆；细胞接种；骨组织工程；颅骨缺损
　　[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0581-05
　　
　　Repairing goat skull clinical defects with tissue engineering bones constructed by a biphasic seeding strategy with platelet-rich plasma
　　LEI Hua,TANG Xiao-Jun,PENG Zhe,NIU Feng,YU Bing,SHEN Shun-ying,GUI Lai
　　(The Sixth Department of Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College,China Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo confirm whether platelet-rich plasma (PRP) biphasic seeding strategy can significantly enhance the osteogenesis in vivo, compared with common biphasic seeding and traditional dropping seeding.MethodsTo construct tissue engineering bones with PRP biphasic seeding, common biphasic seeding and traditional dropping seeding respectively. To repair the goat skull clinical defects with the three groups of tissue engineering bones. At 3 days and 3 months postoperatively, goat skulls were examined by CT scanning, the pictures were analyzed by the Osirix software. Following CT scanning at 3 months postoperatively, animals were executed, the skull samples were harvested and examined histologically.ResultsThe new bone amount of the group of PRP biphasic seeding was significantly more than the groups of common biphasic seeding and traditional dropping seeding (P0.05).ConclusionThe PRP biphasic seeding was safe, efficient and practical. The tissue engineering bone constructed by the PRP biphasic seeding strategy can improve the osteogenesis in vivo.
　　Key words：platelet-rich plasma;cell seeding;bone tissue engineering;skull defect
　　
　　骨组织工程虽已被用于临床，但是仍存在一些问题，如细胞与三维多孔支架材料如何能有效结合的问题。传统的细胞接种方法，是将细胞悬液直接滴加在材料表面。这种方法简便、适合于各种细胞和支架，但是如果三维多孔支架具有疏水性或亲水性不强，不能像海绵一样将细胞悬液吸入内部，大量细胞悬液流失。有时就算细胞悬液进入支架内部的孔洞里，由于没有足够的孔壁贴附，很多细胞液流失了[1-3]。所以有学者利用双相接种法提高细胞和三维多孔支架的结合，也就是将细胞与纤维蛋白原或胶原液体混合，滴加或灌注于支架上，随即滴加促凝剂，使纤维蛋白原或胶原凝固成胶冻状，将细胞固定在支架表面或内部，提高了细胞的接种效率[4-14]。本研究也预用双相接种法构建组织工程骨，但是用富含血小板血浆（platelet-rich plasma PRP）代替纤维蛋白原和胶原重悬细胞，原因是PRP不仅与纤维蛋白原和胶原一样具有双相性，在促凝剂的作用下从液态变为胶冻状，而且含有大量血小板，血小板可被促凝剂激活释放大量活性因子，其中包含多种生长因子，可以促进组织愈合等一系列生物事件[15-16]。所以我们推测PRP双相接种法构建的组织工程骨可能进一步促进骨形成。为证实此假设，本研究分别用PRP，自体纤维蛋白原（platelet-poor plasma PPP），传统静滴法构建组织工程骨，修复山羊颅骨缺损，观察体内骨形成情况。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 BMSCs原代培养及传代：于一只中国青山羊（5月，10 kg）髂后上嵴抽取5ml骨髓（肝素抗凝）。15ml离心管中加入5ml人淋巴细胞分离液（Boster，武汉），将5ml骨髓沿管壁缓缓注入。200g离心，10min。取中层移至25cm2培养瓶中（Corning, Germany），加入高糖DMEM（Hyclone，USA）4ml，其中含有10% FBS（Hyclone，USA），100 U/ml 青霉素（Sigma，China），100mg/ml 链霉素（Sigma，China）。37℃，5% CO2，孵育4 天，换液。继续孵育，3 天换一次液。待细胞90%融合时，0.25%胰酶（Sigma，China）消化、收集细胞至15ml离心管中，200g离心，10 min，弃上清液，DMEM重悬细胞团，以5 000/cm2的密度接种于75cm2培养瓶中，加入10ml培养基，37℃，5% CO2孵育，每3 天换液一次。一般第三代细胞用于实验。
　　1.2PRP和PPP的制备：配置抗凝剂ACD：0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖（中国阿拉丁试剂有限公司）溶于100ml双蒸水中，0.45μm过滤消毒，冷藏备用。于一只中国青山羊（5月，10kg）颈静脉抽取全血40ml，其中加入40ml ACD，摇匀，移入50ml离心管，1 000g离心，15min。取上层血浆，弃红细胞，二次离心，3 000g，20min。上层为清亮的PPP，移入另一15ml离心管中备用。中间层为白色的血小板，轻轻用吸管搅动吸出移至另一离心管中，下层红细胞弃之。用少量PPP将血小板重悬，人工血小板计数，调节成浓度为106/μl的PRP备用[17-19]。
　　1.3 PLGA支架预处理：PLGA支架由济南岱罡生物科技有限公司提供。PLA：PGA=75：25。孔径大小100～300μm，空隙率80%。用11号尖刀片将大块PLGA切成直径11mm厚3 mm的圆盘状。使用前，PLGA圆盘浸泡于75%酒精中24h，PBS漂洗3次，DMEM孵育30 min，取出置于无菌纱布上，吸干水分，再滴加细胞悬液，以增加PLGA的亲水性。
　　1.4 细胞/支架复合体修复山羊颅骨缺损：中国青山羊8只，7～8月，17～20kg。随机分成4组，2只/组。用牙科钻在颅顶部制造2个直径2cm全层颅骨缺损，去除局部骨膜，保护硬脑膜完整。4组动物分别用以下方法修复颅骨缺损：①对照组，不修复，直接分层缝合切口；②DMEM组，用DMEM重悬细胞（2×107/ml），每块PLGA支架滴加500μl细胞悬液，植入颅骨缺损区，不固定，缝合切口；③PPP组，用PPP重悬细胞（2×107/ml），每块PLGA支架滴加500μl细胞悬液，100μl 凝血酶促凝，植入颅骨缺损区；④PRP组，用PRP重悬细胞（2×107/ml），其余同PPP组。术后常规肌注抗生素，青霉素钠 160万U，2次/日，共3天。图1示手术过程。
　　1.5 山羊颅骨缺损修复前后影像学检查：术后3天及8周行山羊头颅螺旋CT (Siemens Somatom 16， Germany) 扫描检查，140 kV，130 mA，层厚1.5mm。用Osirix 软件分析，计算新生骨的体积，并进行三维重建。
　　1.6 山羊颅骨缺损修复8周后组织学检查：术后8周，头颅螺旋CT检查结束后，处死动物，用牙科钻钻取颅骨缺损区样本，取材范围包括颅骨缺损周边2mm正常颅骨在内的所有区域。样本放入4%的甲醛中固定48h，然后酒精逐级脱水，树脂包埋，硬组织切片机（Leica SM2500，Heidelberg，Germany）切片，厚度40μm，HE染色，光学显微镜（Leica DM3000，Germany）观察拍照。Osirix 软件分析，计算各组代表性切片新生骨面积。
　　1.7 统计学分析：每个数值以平均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey"s test 。设P0.05)。对照组 (0.0219±0.00917)cm3 的新生骨显著低于其他3组 (P0.05)。
　　
　　3讨论
　　实验中8只山羊均平稳渡过整个观察期，术后8周取标本时，可见山羊头皮伤口愈合良好，无红肿热痛，头皮下方组织无充血水肿，组织切片显示无明显炎症细胞浸润、血管增生等，支架材料均被吸收，颅骨缺损处已被新生骨和纤维组织覆盖，这说明PRP和PLGA支架修复体内骨缺损是安全有效的。
　　CT冠状位平扫和三维重建图片以及组织学切片都显示用PRP构建的组织工程骨修复山羊颅骨缺损，较PPP双相接种法（普通双相接种法）和传统静滴法构建的组织工程骨有更多的新骨形成。这可能是PRP中的血小板促进植入的BMSCs的增殖分化、趋化宿主基质细胞并促其增殖分化、促进细胞外基质分泌和血管再生，最终使相应的组织再生修复创伤[20]。尽管，这个复杂的生物过程还没有被完全解析，但从我们的实验结果可以肯定血小板在体内骨形成中有一定的促进作用，PRP也较PPP更适合做为双相接种的媒介。
　　以往的研究表明，当PRP与BMSCs混合修复犬下颌骨缺损[17]和兔颅骨缺损时[21]，较单纯PRP或自体骨颗粒更能促进体内新骨形成；当PRP与BMSCs和冻干异体骨颗粒混合修复兔股骨远端髁状突缺损时，表现出较好的促进骨愈合和骨塑性过程[22]；在上颌窦充填、窦底提升时，PRP与BMSCs的混合物较单纯松质骨颗粒或单纯PRP更能促进骨再生[23]。这些研究结果均表明PRP在有BMSCs存在时可以促进骨再生。但是这些研究均是将PRP与细胞或自体骨颗粒直接混合植入受区发挥成骨作用，而本研究首次将PRP做为接种媒介将细胞与三维多孔支架结合，构建组织工程骨，修复骨缺损。这为骨缺损的三维个性化修复中，细胞与三维多孔支架的复合提供新思路。
　　根据以往文献报道，双相接种法的细胞接种效率显著高于传统静滴法[8-11]，所以我们推测PPP组植入细胞初始量较多，成骨也应较多，但本研究结果显示PPP双相接种法与传统接种法构建的组织工程骨在体内成骨数量没有差异，这说明组织工程骨在体内的成骨不单纯与植入细胞的初始量有关，与细胞植入后的增殖分化、宿主基质干细胞的趋化移入、骨缺损局部微环境，等等因素均密切相关，也正因如此，PRP中的血小板的生物作用显得非常重要。不过PPP双相接种法没有显示出较传统静滴法的优势，也可能与实验观察时间短（8w）或样本量小有关(n=4)。这些都有待于深入研究。
　　本研究的观察时间较短(3月)，也许随着时间延长，各组的成骨数量和质量会变得没有差异，但本实验至少可以说明PRP可在早期促进骨形成。
　　
　　4结论
　　本研究结果显示，由于PRP中大量血小板的存在，用PRP介导的双相接种法构建组织工程骨在体内早期成骨显著；而且PRP很容易地由自体全血经两步离心获得，无毒、无免疫源性，所以PRP双相接种法是一个安全、实用、高效的细胞接种方法，可以有效输送细胞至三维多孔支架内的同时，输送自体生物因子，其中包括很多种生长因子。
　　
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　　[收稿日期]2010-12-28 [修回日期]2011-03-20
　　编辑/张惠娟