细胞凋亡的研究进展_皮瓣缺血再灌注损伤与细胞凋亡的研究进展

　　皮瓣移植是整形外科常用的修复组织缺损和器官再造的重要手段。应用游离皮瓣或轴形皮瓣进行组织移植和器官再造时，最常遇见的问题是皮瓣缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion，IR)导致的皮瓣部分或全部坏死。缺血再灌注损伤的确切发生机制目前尚不完全清楚，多认为是多细胞参与、多种介质共同发挥作用的复杂病理生理过程，其中细胞凋亡是造成皮瓣坏死的重要原因。近年来有关各种组织细胞缺血再灌注损伤与细胞凋亡(apoptosis)的关系已经取得了一定进展。本文对细胞凋亡、器官和组织缺血再灌注损伤中细胞损伤的发病机制及其与细胞凋亡的关系、凋亡相关基因的研究进展综述如下。
　　
　　1细胞凋亡
　　
　　细胞凋亡是细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式。此概念由美国病理学家Kerr 等[1] 在1972 年首先提出,是指细胞受到一些特殊信号刺激后,按照内在程序,即细胞预存的死亡程序,由其自身内部机制调控的主动细胞死亡,属于机体自身的生理活动, 又称为程序性细胞死亡(programmed cell death ,PCD) 。细胞凋亡过程受基因严格调控,与细胞坏死有显著的差别。
　　1.1细胞凋亡的机制：细胞凋亡是细胞在其生长、发育过程中具有十分重要作用的生理现象。其生物学意义是在发育过程中清除多余的细胞、发育不正常的细胞、已完成任务的细胞以及有害的细胞,参与免疫系统细胞的发育和克隆选择等,是确保机体正常生理过程所必须的。随着研究的深入,人们认识到细胞凋亡和细胞的生长、分化、消亡以及机体的许多生理和病理过程密切相关。
　　1.2细胞凋亡的过程：可分为三期：①诱导期：凋亡诱导因素作用于细胞,导入死亡信号； ②执行期：凋亡相关基因激活,决定死亡的细胞按预定程序启动凋亡,激活凋亡所需的核酸内切酶、凋亡蛋白酶等及降解相关物质,形成凋亡小体；③消亡期：凋亡细胞被邻近的细胞所吞噬并在吞噬细胞内降解。
　　1.3细胞凋亡的形态学改变:微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失,胞膜迅速空泡化,内质网不断扩张并与胞膜融合,形成膜表面的芽状突起,即出芽；胞质脱水而导致细胞皱缩、致密及固缩,线粒体变大,嵴增多,空泡化；核内染色质浓缩,形成染色质块,边聚或中聚；胞膜皱缩内陷,分割包裹胞质,形成泡状小体即凋亡小体,这是凋亡细胞特征性的形态学改变。凋亡小体迅即被邻近的细胞吞噬和消化。整个凋亡过程没有细胞内涵物的外溢,故不引起炎性反应与周围组织损伤。
　　1.4 细胞凋亡的生化改变:细胞染色质DNA 的降解是细胞凋亡的一个显著特征。细胞凋亡发生时,Ca2+/Mg2+ 依赖性核酸内切酶激活,切割核小体间的DNA,最后形成长度为180～200碱基对(bp)或其整倍数的片段,在琼脂糖凝胶电泳中呈“梯”状(ladder pattern) 条带,是判断凋亡发生的客观指标。
　　
　　2缺血再灌注损伤
　　
　　缺血的组织、器官经恢复血流灌注后不但不能使其功能和结构恢复,反而加重其功能障碍和结构损伤的现象称为缺血再灌注损伤（IR）。这是一种常见的病理生理过程,可发生在脑梗死、心肌梗死、休克、手术创伤、肝门阻断术及皮瓣移植和器官再造过程中。关于缺血再灌注损伤的发病机制与下列因素密切相关。
　　2.1 自由基生成增多
　　2.1.1黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤生成增多:组织缺血时，一方面由于ATP生成减少，膜泵功能障碍，Ca进入细胞，激活Ca依赖性蛋白水解酶，使细胞内大量黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，另一方面，ATP被降解为ADP、AMP和次黄嘌呤，故在缺血时组织内次黄嘌呤大量堆积。再灌注时，大量分子氧随血液进入缺血组织，在黄嘌呤氧化酶将次黄嘌呤转化为黄嘌呤并进而催化黄嘌呤转化为尿酸的两步反应中，都以分子氧为电子接受体产生大量氧和过氧化氢，后者在金属离子参与下形成OH，因此再灌注时组织内氧、OH等氧自由基大量产生。
　　2.1.2 中性粒细胞的大量积聚和激活[2-3]：中性粒细胞在吞噬活动加强时耗氧量显著增多，所摄取的氧绝大部分经白细胞内的NADPH氧化酶和NADH氧化酶的作用形成超氧阴离子，如果形成的自由基过多或机体清除自由基的酶系统活性不足，则导致氧自由基增多。
　　2.1.3 线粒体功能受损：缺血再灌注时，Ca进入线粒体增多，使其功能受损，细胞色素氧化酶系统功能失调，进入细胞的氧经单电子还原而形成氧自由基。
　　2.1.4 酚胺的增多和氧化：在各种应激包括缺氧条件下，交感-肾上腺髓质系统可分泌大量儿茶酚胺，一方面它具有重要的代偿作用，另一方面儿茶酚胺氧化时能产生具有细胞毒性的自由基。
　　2.1.5 四烯酸代谢过程增强：缺血再灌注时，由于细胞内钙超载激活了Ca依赖性磷脂酶，引起花生四烯酸代谢产生大量氧自由基。
　　2.2 钙超载的机制
　　2.2.1 近年来大量研究表明Na+/Ca2+交换是调节细胞内钙离子平衡的主要途径[4-6]。IR时组织内ATP生成减少，细胞内酸中毒，Na+在细胞内积聚，激活了Na+/Ca2+交换系统，使大量Ca进入细胞内形成钙超载。
　　2.2.2 IR时大量自由基产生，作用于钙通道，增加Ca2+通透性，而且由于ATP生成减少，钙泵排Ca2+的能力下降，导致细胞内Ca增多。
　　2.3能量代谢障碍：实验证明，在缺血再灌注时，由于缺氧和血流量不足，组织缺血，可导致能量代谢障碍，ATP明显下降。可进一步引起一系列代谢异常和紊乱：①组织缺血时，组织内ATP生成减少，细胞内酸中毒，导致氧自由基产生增加。此外酸中毒又可直接损害细胞的超微结构，使Ca2+通道通透性增加，致使Ca2+内流增加。同时Na+在细胞内积聚，激活了Na+/Ca2+交换系统，使Ca2+进入细胞内形成钙超载；②随ATP含量的下降，细胞膜、肌浆网Ca2+-ATP酶活力及肌浆网钙摄取能力下降，使细胞内Ca2+增加；③依赖ATP的细胞膜泵活性降低，肌钙蛋白C亲和力下降，使Ca2+增加。
　　2.4 血管内皮细胞功能障碍
　　2.4.1 内皮细胞抗氧化系统损伤：研究证明[7]内皮细胞的抗氧化活性与其对氧化活性的敏感性之间有一定关系。组织缺血再灌注时,内皮细胞不仅产生大量的活性氧,而且其抗氧化活性大大降低,并对外源性的活性氧产生系统有较高的敏感性,从而引起大量活性氧的产生,远远超过了内皮细胞的防御能力,最终引起组织的损伤。
　　2.4.2 内皮细胞合成与释放血管活性物质的功能障碍：①内皮源性血管舒张因子NO是内皮细胞产生的强大舒血管物质,可通过弥散或载体转运至血管平滑肌,活化细胞内鸟苷酸环化酶,使环磷鸟苷(cGMP)升高而扩张血管;同时还具有抑制血小板和白细胞粘附、抑制平滑肌细胞增殖作用,在缺血再灌注中对组织具有保护作用；②内皮素( ET)在组织缺血时释放增加,再灌注时ET释放进一步增加,引起强烈的血管收缩,可直接引起组织缺血,加重血管功能障碍,使细胞发生不可逆性损伤；③缺血再灌注损伤引起中性粒细胞与内皮细胞的粘附增加,中性粒细胞与血管内皮接触时即被激活,释放OFR等毒性产物及破坏性蛋白酶,改变血管的通透性。同时活性氧产生的增加,损伤了内皮细胞和其他细胞,其作用于内皮细胞或粒细胞表面的粘附分子,促进内皮细胞的粘附,而缺氧本身也损伤内皮功能,改变其粘附性,最终导致内皮细胞破损、水肿和功能障碍,毛细血管腔被阻塞,导致虽有大血管的再灌注但局部缺血区仍无复流的现象[8]。
　　2.5 缺血再灌注时，组织细胞产生大量细胞因子和生长因子致组织损伤：组织发生缺血再灌注损伤后，由于氧自由基、髓过氧化物酶及弹性蛋白酶的大量产生，血小板活化因子及许多炎症介质如激活的补体、白介素（IL-1、IL-6、IL-8、TGF）、TNF等大量释放，以及细胞周围环境中的生长因子（血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子）等，引起内皮细胞或白细胞表面特殊粘附分子的表达，从而使细胞粘附蛋白介导的中性粒细胞与内皮细胞发生粘附，诱导中性粒细胞穿内皮迁移以及对缺血组织的浸润和损伤。并通过诱导细胞凋亡因子的产生，进一步对组织细胞造成损害。
　　2．6 缺血再灌注损伤时细胞凋亡的相关凋亡基因:研究发现，在缺血再灌注的发生发展过程中，Bcl-2基因家族、Fas基因、P53、caspase、即早基因等多种凋亡基因均参与了凋亡的发生。这些调控基因相互调节和制约，构成了一个复杂的网络体系，共同调控着缺血再灌注后细胞凋亡的发生。
　　目前多数学者认为，IR是各种因素相互作用、相互促进共同作用的结果。IR时生成的自由基可促进钙超载，胞浆内游离钙增加又加速自由基产生，共同导致IR损伤。血管内皮细胞和中性粒细胞作为IR中自由基、细胞粘附分子及其他生物活性物质的重要来源，在IR损伤的发生发展中起重要作用，此外细胞代谢紊乱及其产生的细胞因子诱导产生的细胞凋亡因子也参与了IR损伤过程。
　　
　　3皮瓣缺血再灌注损伤与细胞凋亡
　　
　　近年来大量的研究表明，缺血再灌注损伤的发生不仅来自缺血再灌注的直接作用,同时凋亡机制的启动与放大后造成的组织坏死同样也参与了上述组织的损伤过程。Schumer等 ［9］在缺血再灌注的大鼠肾脏组织观察到细胞凋亡现象与缺血再灌注的关系。Gottlieb [10]于1994年首次在兔心脏上验证了再灌注损伤所导致的心肌细胞凋亡 。有研究进一步表明，细胞凋亡是组织缺血再灌注损伤后细胞死亡的重要方式,并且组织缺血再灌注后细胞凋亡的发生与缺血的严重程度、再灌注时间的长短有关。其中Kuo等[11-14]进行实验证实，凋亡细胞量的增加和再灌注损伤的程度相关，而且凋亡的程度与缺血再灌注损伤的生化和病理学参数成正相关。同时还在观察中发现，当组织细胞发生缺血再灌注损伤时，未发生缺血的组织细胞在灌注后也发生细胞凋亡现象。从而推断组织细胞发生凋亡后，可诱导相应的凋亡分子和凋亡诱导分子释放，导致正常的组织细胞发生死亡。概括起来缺血再灌注损伤与细胞凋亡存在如下关系：
　　3.1缺血再灌注损伤时氧自由基增多与细胞凋亡的关系：许多研究表明,氧自由基与细胞凋亡密切相关，可启动细胞凋亡。其机制为[15]：①直接损伤DNA ,诱导细胞凋亡； ②诱发细胞膜脂质过氧化,从而影响信号转导系统,激活相关促凋亡基因,导致细胞死亡； ③导致蛋白质交联,使具有酶活性的蛋白质功能丧失；④影响核基因的转录,改变细胞的表型特征,诱导细胞凋亡。
　　3.2缺血再灌注损伤所致钙超载与细胞凋亡的关系：钙超载是组织缺血再灌注损伤的重要机制,也参与细胞凋亡过程,但其具体机制尚不清楚。可能与以下因素有关：①激活Ca2+ 依赖性磷酸酶,破坏线粒体结构和功能,ATP 生成减少,同时引起Bcl-2 蛋白失活；②促进氧自由基的生成，进而促进细胞凋亡的产生；③激活Ca2+ 依赖性的核酸内切酶,降解DNA；④激活Ca2+ 依赖性中性蛋白酶(caplain),介导TNF 信号转导通路和调控p53,从而诱发细胞凋亡。
　　3.3缺血再灌注损伤时线粒体通透性改变和能量代谢障碍与细胞凋亡的关系：细胞凋亡有两条分子信号通路，其一为受体介导的死亡信号通路，主要由外源性信号引起。另一凋亡通路由线粒体介导，主要由内源性信号所引起。通过细胞色素C的释放，激活caspase 9 ,引起caspase级联反应。另外线粒体膜腔内还释放许许多多肽，对凋亡起重要的调控作用。线粒体通透性改变可以作为死亡的闸门[16],不但决定细胞的死亡或者生存,而且决定细胞的死亡机制,即凋亡或坏死。至于细胞走向凋亡还是坏死则取决于线粒体内ATP水平[17]。在组织缺血情况下，细胞若仍能以糖酵解的方式提供ATP,则细胞走向凋亡。如ATP 已耗竭,则细胞走向死亡。
　　3.4缺血再灌注损伤时所释放细胞因子与细胞凋亡关系：组织缺血再灌注损伤时,应激产生大量的细胞因子,如TNF、IL-6、IL-8、TGF 等,以及细胞周围环境中产生大量的生长因子（如：血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子等），通过细胞内蛋白质酪氨酸激酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶介导，引起组织细胞凋亡。研究发现直接注射TNF-α到活体组织内,有凋亡典型的DNA 梯带出现[18],同时TNF-α还可致组织内皮细胞发生凋亡[19]。TGF-β为多种上皮组织增殖抑制因子,体内外实验证实TGF-β可诱导组织细胞凋亡。经过有丝分裂原诱导组织细胞凋亡的组织中,TGF-βmRNA 表达水平增高,说明TGF-β有致细胞凋亡的作用[20] 。
　　3.5缺血再灌注损伤时凋亡相关基因产生与细胞凋亡的关系：有研究发现，在缺血再灌注中，有多种凋亡相关基因参与细胞凋亡的发生。凋亡相关基因多达数十种,根据功能不同可分为：①抑制凋亡基因：如Bcl-2； ②促进凋亡基因:Bcl-2 家族中的bax、Hrk、野生型p53；③双向调控基因即早基因(IEGs)等，其中对Bcl-2 在缺血再灌注损伤中表达的研究较为深入。
　　3.5.1 Bcl-2 基因：Bcl-2 是缺血再灌注损伤中最重要的抗细胞凋亡基因,主要分布在线粒体膜、内质网膜、核膜等处。Bcl-2抗凋亡的机制为：①直接的抗氧化； ②调节线粒体功能:Bcl-2可抑制MTP 的功能,减少细胞色素C 的释放,阻止凋亡蛋白酶的激活；③维持细胞Ca2+ 稳态,细胞内Ca2+ 浓度的升高是细胞凋亡的始动因素,Bcl-2 高表达可抑制内质网释放Ca2+ ；④Bcl-2 与同族基因的bax 形成二聚体，Bcl-2 能抑制bax 诱导的细胞色素C释放,阻止细胞凋亡。Bcl-2/Bax表达后的比例是决定细胞凋亡敏感性的变阻器[21]。
　　3.5.2 Fas：Fas是一种细胞表面受体,属于肿瘤坏死因子受体(TNFR) 家族,Fas配体(FasL)属于TNF家族成员。Fas受体配体系统是激活细胞凋亡的最主要的受体介导途径。Fas受体与FasL结合激活后,启动凋亡信号的跨膜传递,Fas的“死亡区段”(death doman,DD)与Fas死亡结构域相关蛋白（FADDPMORT1）结合,并激活天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)8,进而导致caspase3的激活和一系列的级联反应,以Ca2+非依赖的形式诱发凋亡[22]。
　　3.5.3 p53基因：p53是与细胞DNA修复有关的重要细胞周期调控基因。野生型p53诱导细胞凋亡,突变型p53则抑制细胞凋亡。损伤后细胞核中野生型p53很快聚集,使细胞停止于G1PS 期,这使细胞难以恢复重新进入细胞周期。如DNA损伤过于严重,DNA 无法恢复,则产生细胞凋亡。同时研究还发现,野生型p53 能下调Bcl-2的表达[23]。p53 在不同细胞中诱导凋亡的机制不同,但最终都是通过细胞色素C释放和caspase的激活而完成细胞凋亡。
　　3.5.4 caspase 基因家族：caspase 基因家族为半胱天冬氨酸蛋白酶家族,在细胞内以非活性的酶原形式存在,激活后通过caspase 级联反应,引起蛋白分解,驱动细胞凋亡的发生。Cursio[24]的研究表明在肝缺血再灌注损伤（HIRI）后caspases 活性增加,提示caspases 的活性与HIRI 后细胞凋亡的发生密切相关。
　　3.5.5 即早基因(IEGS)：IEGS 是一组快速表达并参与细胞信息传递、生长、分化和损伤修复的原癌基因,包括c2fos、c2jun、c2myc等。IEGS编码的蛋白在核内起着转录因子的作用。IEGS在细胞凋亡过程中被激活,不仅可调节细胞凋亡程度,而且可促进细胞增殖。
　　
　　4小结
　　
　　皮瓣缺血再灌注损伤是一个多因素、多环节、多途径参与的复杂的病理过程,细胞凋亡是其损伤的一个重要特征。随着对细胞凋亡研究的进一步深入,皮瓣缺血再灌注损伤的病理生理过程将会进一步得到揭示,从而为在分子和基因水平防治皮瓣缺血再灌注引起的细胞损伤提供理论依据,为进一步完善临床治疗提供新的有效途径。这主要体现在以下两个方面：①针对凋亡发生的不同环节,如消除或阻抑刺激因子,阻断凋亡的信息传导通路,如基因治疗；②开发调节细胞凋亡的新药物。
　　
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　　[收稿日期]2008-06-03[修回日期]2008-08-06
　　编辑/李阳利