辣椒素脂质体在兔耳增生性瘢痕组织中的透皮吸收研究:脂质体

　　[摘要]目的：探讨脂质体包裹的辣椒素对兔耳增生性瘢痕组织的透皮吸收能力。方法：在兔耳增生性瘢痕模型上进行透皮扩散，比较辣椒素脂质体及其普通商用软膏剂对瘢痕皮肤的渗透能力。结果：在体瘢痕透皮试验12h后，脂质体组瘢痕组织中的辣椒素单位面积透皮药量显著高于软膏组(40.03±3.2 vs 9.01±2.02μg/cm2，p＜0.01)。结论：在体瘢痕组织透皮试验中，脂质体剂型均表现出优于软膏剂型的促进辣椒素透皮的能力。
　　[关键词]脂质体；辣椒素；增生性瘢痕模型；透皮扩散；
　　[中图分类号]R94 R622　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)07－0881－04
　　
　　目前在瘢痕的药物治疗研究中发现，多种药物在体外对瘢痕成纤维细胞均有显著抑制作用，但临床上此类药物的常用外用剂型如软膏、霜剂等，局部应用却不能达到较好效果，这与皮肤的特殊结构一角质层以及瘢痕缺乏皮肤附件而阻碍了药物进入皮肤有关。因此找到一种疗效好、全身毒副反应小、又能导入瘢痕皮内并保持较长作用时间的药物和方法是瘢痕防治的关键。
　　辣椒素(capsaicin，CAP)是一种天然的植物碱，是辣椒中的主要生物活性成分。作为神经肽P物质(substance P，SP)的耗竭剂，新近的研究报道辣椒素具有显著的抗纤维化作用，可用于瘢痕的防治。
　　脂质体(liposome，Lip)作为一种透皮给药新剂型，具有皮肤组织靶向性、缓释性和无毒性的特点。已有的关于辣椒素脂质体制剂在瘢痕组织离体透皮实验中，已显示了其优于常规局部软膏制剂的促渗透能力的特点。因此，Lip非常有望成为增生性瘢痕局部治疗药物的良好载体。本实验以兔耳增生性瘢痕模型为对象，对辣椒素的普通软膏制剂和脂质体制剂的透皮能力进行比较，为寻找一种安全、有效、方便的外用抗瘢痕药物提供理论依据。
　　
　　1　仪器与试剂
　　
　　1．1　材料：新西兰大白兔；辣椒素标准品(美国SIGMA公司)；辣椒素原料药(厦门大学)；0.075％(质量比)辣椒素脂质体(自制)；0.075％(质量比)辣椒素软膏(贵州康运药业)；甲醇、乙氰(均为色谱纯)；其他试剂为分析纯。
　　
　　1．2　仪器：Waters高效液相色谱仪(美国Water公司)，包括Waters 515型泵，Rheonyde7725i进样器，2487双波长紫外检测器，ChromStationTM色谱数据处理工作站；T18匀浆机(德国IKA公司)；DL－360超声仪(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)；TGL－16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)。
　　
　　2 方法
　　
　　2．1　检测方法
　　2．1．1　色谱条件以及标准曲线：色谱柱：C18柱；流动相：乙氰：水=60:40，(V:V)；流速：1.2ml/min；检测波长：280nm：进样量：20μl；室温操作。精取辣椒素5mg，置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得1×103 mg/L辣椒素储备液。精密量取该液25、50、100、200、400μl分别置于10ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，得到2.5、5、10、20、40 mg/L的标准液。进样20μl，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，相应质量浓度为横坐标进行线形回归。
　　2．1．2 回收率与精密度：精密量取线性试验下的中间三个浓度的标准液，依法各自进样3次测定并计算回收率和精密度。
　　
　　2．2　制作瘢痕模型
　　2．2．1　实验动物：选用健康成年新西兰大白兔12只，兔耳健全，雌雄不拘，体重3.0－3.5kg，分笼饲养。
　　2．2．2　参照Morris氏方法并加以改良建立兔耳增生性瘢痕模型：①用速眠新0.1ml/kg肌注全身麻醉；②严格无菌操作技术下，在兔耳腹侧面做1cm×1cm大小创面，去掉兔耳全层皮肤及软骨膜，创缘用烙铁适当烧灼处理，每只兔耳做4个创面，共96个创面；③术后创面暴露，保持干燥待创面自行愈合，一般需要18－21天。
　　
　　　2．3　在体瘢痕透皮实验及其检测
　　2．3．1　手术后约19天创面完成上皮化时，伴有瘢痕增生，才达到在体透皮扩散实验的要求。用游标卡尺对创面瘢痕进行测量，以标化用药面积。
　　2．3．2　随机将12只兔的一侧耳设定为辣椒素脂质体用药组，另一侧用辣椒素软膏作对照组。每一侧的四个标本中随机选取三个用药，余下一个作阴性对照。在每个用药的瘢痕上分别均匀地涂抹等量两种制剂，并确保最终辣椒素的用量为100μg，于首次用药后间隔6h复用等量的药物一次，共用2次。涂药范围严格掌握在瘢痕边缘内1mm处。
　　2．3．3　末次给药6h后处死动物，取软骨以上瘢痕皮肤和鲜血为待检测标本。
　　2．3．4　瘢痕标本后处理：①透皮扩散实验结束后，瘢痕皮肤先用沾有甲醇的试纸搽拭2次后，再用纯水冲洗数次，尽量去除皮肤表面残留的药物；修剪瘢痕组织，确保最后送检组织为瘢痕标本表面预标记所对应的实际用药的瘢痕组织；②然后用相同长度的3M胶带粘拉表皮面9次，使角质层与活性表皮层和真皮层分离，分别将3M胶带连同上面粘附的角质层记作标本1(即：角质层部分皮肤)和余下皮肤作为标本2(即：非角质层部分皮肤，简称非角质层)；③分别将标本1和标本2剪碎后置于不同的玻璃器皿中，然后加入蒸馏水2ml用高速匀浆机匀浆处理，至皮肤被研磨成浆，再转移至10ml离心管中，加入甲醇8ml超声萃取5min，离心(10000r/min，10min)取上清液，用0.5μm孔径的滤膜过滤后备测；④角质层和其余皮肤中辣椒素含量的测定：将标本1、2和血清液各20μl用HPLC法按“2．1．1”项下条件检测CAP的含量。
　　
　　3　结果
　　
　　3．1　标准曲线、回收率和精密度：标准曲线的回归方程为：Y=1496.5X+2922.1，r=0.998。CAP浓度在2.5－40.0 mg/L内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。；CAP的平均峰面积为：3523.1，RSD为：0.89％，表明本方法具有良好的精密度。

　　
　　3．2　在体瘢痕透皮实验：CAP－LIP组和CAP－CRE组瘢痕组织，各自的角质层和非角质层皮肤中，药物滞留量之间的差异经过SAS8.0软件作t检验分析，P＜0.01，提示两种制剂的CAP单位面积滞留量的差异有显著性意义。所有同时抽取之血清和各阴性对照的瘢痕组织各层中均未见有CAP检出。

　　
　　4 讨论
　　
　　许多研究证明神经肽对伤口愈合发挥着重要调节作用。SP就是其中重要的神经递质之一。作为神经递质、调质、神经源性炎症介质，免疫调节肽可能参与了伤口愈合的全部生理修复过程，同时在瘢痕不断增生的病理过程中也起着重要作用。作为神 经肽SP的拮抗药物，CAP在创伤愈合中，可耗竭部分神经肽类物质，减少其局部浓度，瘢痕的另一典型临床症状是瘙痒，在增生的早期症状尤为明显，可能与肥大细胞的脱颗粒释放组织胺等有明显的关系。因此，通过运用辣椒素来抑制SP的增加，达到控制瘢痕的发生和瘙痒症状，能从多途径控制伤口愈合过程和瘢痕的发生和发展，从而达到防治瘢痕形成的目的。
　　关于增生性瘢痕的防治，目前乃整形外科的一大难题。临床上虽有多种防治方法，如手术切除、压迫疗法、放射治疗等，但这些方法不仅时间长、治疗需医生实施、应用不方便，而且效果也不甚理想、瘢痕易复发。目前在药物治疗研究中发现，多种药物如秋水仙碱、青霉胺、β-丙晴酰胺、γ-干扰素等，在体外对瘢痕成纤维细胞均有抑制作用，但在口服或静脉应用时对瘢痕的作用较小、全身毒副反应也较大。临床上激素类药物有明显抑制瘢痕的作用，但需注射于瘢痕内效果才明显，而其常用外用剂型如软膏、霜剂等，局部应用却不能达到较好效果，这与皮肤的特殊结构一角质层以及瘢痕真皮增厚、缺乏正常皮肤的附属结构(毛囊、汗腺、皮脂腺)阻碍了药物进入，影响了药效有关。因此找到一种疗效好、全身毒副反应小、又能导入瘢痕皮内并保持较长作用时间的药物和方法是防治作用的关键，同时也能方便患者直接用药。
　　在药物透皮新剂型中，Lip的出现是透皮给药领域的重大进展。Lip系将药物包封于类脂质双分子层形成的微型泡囊中，作为药物载体Lip在应用中具有皮肤组织靶向性、缓释性、兼溶性、无毒性的特点。因此，Lip与一般促渗剂相比较的一大优势，就在于Lip促进药物透过角质层屏障并在局部富积，而不增加药物的全身吸收，减少了药物的毒副作用，为透皮给药系统提供了一个安全、高效、局部无刺激的用药途径，解决了如何将药物导入皮内并局部蓄积而充分发挥其作用的关键问题。
　　体外促渗透实验研究中，我们已经证实Lip能够协助包被的CAP透过皮肤表面角质层进入瘢痕组织，并且，获得局部高浓度；而使用上市的普通软膏剂型，药物难以有效地进入瘢痕组织内，说明辣椒素脂质体对人的离体瘢痕组织具有良好的渗透能力并能在瘢痕组织内蓄积。由于体外实验与在体实验的差异，体外透皮实验只能提示药物所具有的透皮能力，所以不能作为活体实验的定量指标。因此，本实验中我们采用兔耳瘢痕模型，对辣椒素脂质体的体内透皮情况作进一步地研究。
　　创伤后瘢痕愈合是人类特有的一种病理现象，由于在动物身上难以再现这种疾病，使得对其研究受到极大的制约。1997年Morris等以及国内学者李荟元利用兔耳建立了增生性瘢痕模型，并证实兔耳增生性瘢痕与人类增生性瘢痕的发生过程及其结构有着较为相似的病理组织学特征。
　　在兔耳的瘢痕模型在体透皮实验中，结果显示：辣椒素脂质体在真皮中的透皮量极显著地高于辣椒素软膏(近4.5倍)，而且在表皮中的贮存量显著高于辣椒素软膏组(近1.5倍)。由此说明，与体外的透皮实验结果相同，在体情况下辣椒素的脂质体剂型同样具有优于普通软膏剂的促渗透效果，在瘢痕的活性表皮和真皮组织中，有较高浓度的药物。对比人的离体瘢痕的体外透皮实验和兔耳瘢痕模型的在体透皮实验结果可知，同一剂型的药物在体的透皮药量均多于离体实验的透皮药量。这种差异可能源于人和兔不同种属动物之间本质的皮肤渗透性差异、离体和在体的不同环境和理化条件之间造成药物动力学的差异，对它们的理解将有助于我们在今后的实验中，选取更为恰当的动物模型完成透皮观察和药效学实验。
　　在瘢痕性疾病的防治上，强调局部药物靶向给药和局部持续的高药物浓度，那么本实验辣椒素的脂质体制剂所表现出的良好的促渗透能力，无疑从药剂学方向上为经皮给药防治瘢痕性疾病带来了新的希望。当然，本实验仅仅是对将脂质体应用到瘢痕透皮给药的一次初探，不论是在实验模型用药的设计和有关检测方法上有待进一步完善，还是从配方组成和工艺流程，达到改善辣椒素脂质体的包封率、稳定性优化剂型等制剂水平方面入手，都可能会为提高辣椒素脂质体的透皮扩散能力和瘢痕局部用药模型的建立提供坚实的基础。