nejmoa长效戊肝疫苗研制成功

　 长效戊肝疫苗摘要背景：戊肝病毒是引起急性肝炎的原因之一，然而长期有效的戊肝疫苗还有待确定。研究方法：在初期疗效研究中，我们随机选择16-65岁的健康受试者，分为两组：戊肝疫苗组（疫苗组56302人）、乙肝疫苗组（对照组56302人）。在初期研究中，所有受试者均在0、1、6个月时注射1个剂量的疫苗（共3个剂量），并随访19个月（观察短期疗效）。在延长随访研究中，采用随机、双盲、对照的原则，评价疫苗的长期疗效、免疫原性和安全性，为期4.5年。结果：在4.5年的研究期间，共发现60例戊型肝炎，其中疫苗组7例（0.3/10000人/年）、对照组53例（2.1/10000人/年）。经意向性治疗原则分析后得出：疫苗组约86.8%的受试者疗效反应为有效。对免疫原性评估发现：4.5年后与初始血清反应性阴性相比，疫苗组仍有87%的受试者血清HEV抗体阳性，而对照组HEV抗体滴度仅为9%。两组的不良事件发生率未见明显差异。结论：戊肝疫苗能刺激机体产生长期有效的抗体。

　HEV是全球急性肝炎发生的一个常见原因。HEV有两个主要的流行病学感染途径。最常见的感染途径是水源性感染，主要由1或2型HEV引起的，在发展中国家多见，而且经常是大面积的长周期的爆发性感染，或散在发生于怀孕妇女（死亡率高）。第二种感染途径为动物-人、人-人际间的传播，常由3或4型HEV引起，广泛发生在发展中国家和发达国家。Rein等人预测，在1型HEV流行的地方每年有3，300，000人被感染，导致70000人死亡、3000胎儿死产。但这也许还低估了HEV的可怕性，据最近的一份研究显示，近孟加拉国一个地方，每年就至少有1000名孕妇感染戊型肝炎。虽然HEV在发达国家造成的疾病负担至今仍然没有明确的评估，但HEV是发达国家急性病毒肝炎发生的一个重要原因。HEV感染有广泛的临床表现。在大部分的患者中，其临床症状常常无法和其他类型的急性肝炎相鉴别，而且具有自限性、不易发展成慢性肝炎（除了严重的免疫缺陷性患者）的特点。其易感人群主要有孕妇、老年人和慢性肝脏疾病者；总死亡率约为1-3%，孕妇死亡率为5-25%；肝外临床表现有胰腺炎、关节炎、再生障碍性贫血及神经系统并发症（此与欧洲当地的HEV有关）。基本环境生是预防HEV感染的首要防线，但是在最近的HEV爆发事件中（苏丹南部和乌干达北部），环境卫生的干预并没有阻止感染事件的发生。因此，我们更需要安全有效的戊肝疫苗。我们已知感染人类的HEV主要属于同一血清型，这为疫苗的研制提供了便利。GlaxoSmithKline和Xiamen Innovax Biotech公司研发的HEV-1型重组疫苗已在临床试验中验证了其短期疗效。后者生产的疫苗（商品名“益可宁”）从2012起已在中国投入使用。但是，长期有效的乙肝疫苗还没有研制成功。研究方法受试者：在2007年，我们共招募112604名16-65岁的受试者，随机、安慰剂对照的原则下实行临床3期试验验证益可宁（戊肝疫苗的商品名）的短期疗效。19个月的后，数据分析的结果符合商品注册的目标，并在中国得到了许可证。在随后的延长随访研究中，所有受试者在双盲的原则下持续观察54个月。整个试验期间，我们通过指纹采集和数码射片来识别和追踪受试者，通过免疫（血清抗体）、血液采集、定期随访来评价疫苗功效。所有受试者均签署知情同意书。研究监督该试验经江苏省伦理委员会批准，所有的作者均承诺试验数据完整、准确和真实，并签署诚信协议。Xiamen Innovax Biotech 提供戊肝疫苗作为试验对照和实验室研究，涉及定期评价、严重不良事件及其结果分析。研究中机密数据未向Xiamen Innovax Biotech公开。过程研究设计如下图1所示，在最初的疗效研究中参与者随机分配并分别给予3个剂量的戊肝疫苗（疫苗组）和乙肝疫苗（对照组，Beijing Tiantan Biological Products），继之随访记录感染戊型肝炎的发生事件和严重不良事件。23

　随访缺失的受试者总结在补充表1中。我们通过检查血清样本中的HEV- IgG抗体来评估疫苗的免疫原性。疫苗接种之前我们留取标本作为对照，疫苗接种之后每隔一段时间抽取一次样本。所有受试者、调查人员、研究部门及Xiamen Innovax Biotech公司人员均不知道受试者的人员分配。只有在所有研究数据均安全有效的封存时才能破盲。可疑的感染者通过完善的肝炎监管程序来确定。所有受试者都会被及时告知/提醒需要的实验室检查（免费完成），而且如果感染了戊型肝炎可按协议得到一定的医疗赔偿金。当参与者出现了一定的肝炎症状时，如黄疸、食欲下降、疲乏、上腹部痛等，应及时就医。为确保安全，研究区域内的卫生保健中心均参与到试验中（11个乡镇中的200多个个村落私人诊所和城镇医院）。任何受试者一旦出现肝炎相似的临床症状3天及其以上，我们就会检验其肝功能情况（谷丙转氨酶水平）。其谷丙转氨酶水平至少达到正常值上线（男性40U/L、女性31U/L）的2.5倍才能诊断为急性肝炎。持续获得的血清样本送于中心检验室检测。HEV感染的诊断必须符合2个以上的以下标准：1、HEV-IgM抗体阳性；2、HEV-RNA阳性；3、疾病期间HEV-IgG抗体水平至少是感染前的4倍。前19个月中HEV感染病例由数据安全监管委员会确认，从19个月至54个月间的HEV感染病例由调查人员根据上述诊断标准来确认。实验室检测结果根据说明书使用酶联免疫试剂盒（北京万泰生物制剂），能够检测HEV-IgM、HEV-IgG、HAV-IgM、HBVcAb、HBVsAb、HCV-Ab。检测的HEV-IgG水平使用世界卫生组织单位（WU）表示，检测极限为0.077WU/ml。如果参与者检测出HEV-IgM阳性或HEV-IgG抗体水平增加至2倍以上，我们将会进一步检测其HEV-RNA水平。在延长随访期间，我们回顾了所有的住院记录和死亡记录，以确定可能已经住院或有其他不良事件的试验受试者。在疫苗的安全性分析中，被编码为戊型肝炎的不良事件的数据被排除在安全性分析之外。统计分析我们对第一、二阶段的试验数据进行采集并分析疫苗的疗效。我们采用了3种疗效分析模式：一、符合方案集分析PP（数据来源于均完成3个剂量注射后的7到54月间的疫苗组和对照组，即7-54个月间；）二、意向性治疗分析ITT（数据来源于至少完成1个剂量注射后的7月到54月间的疫苗组和对照组）；三、优化性意向性治疗分析（数据来源于至少完成1个剂量注射的0到54月间的疫苗组和对照组）。对疫苗组、对照组的进行差异性分析，计算疫苗的有效性和95%可信区间。假设在疫苗组和对照组感染戊型肝炎的人数符合独立泊松随机变量的条件下，我们采用一种精确的条件程序评价疫苗疗效。24为了检测结果的可靠性，我们还使用了Cox比例风险模型和Log-rank检验（比较两组间戊肝的累计发生率）进行分析。在免疫原性方面，我们进行数据采集的患者需要符合以下条件：1、至少完成一个剂量的疫苗注射；2、分别在“基线水平”、“7个月时”、“7个月后的至少1个时间点处”有可使用的血清学实验结果。在几何平均浓度计算中，我们设定血清反应阴性的样本浓度为0.04WU/ml。通过意向性治疗原则分析人群中严重不良事件的发生率评估疫苗的长期安全性。使用双边Fisher’s确切检验比较各组间严重不良事件发生率和95%置信区间（未将调整的多重比较）。应用9.1版SAS软件分析数据。所有的P值均在双边＜0.05时存在统计学意义。为了维持研究的双盲原则，我们邀请一位外来的统计学家完成疫苗疗效分析。结果疫苗疗效参与初期疗效研究的受试者随访时间为54±4.2个月（见图1、表S1）。戊肝感染病例共有60例，其中23例发生在初期研究、37例发生在延长随访研究中。疫苗组戊肝累计发生率较对照组有显著性减少（在优化意向性治疗分析中P＜0.001）（见图2）。值得强调的是60例中有53例发生在对照组，7例发生在疫苗组。这7个人中，3位受试者完成了3剂量的戊肝疫苗接种、1位接种2个剂量的疫苗，其余3位仅接种1个剂量的疫苗。而且其肝炎症状严重程度为中度或轻度，也没有死亡或肝衰竭的病例报告。同时，在临床表现方面疫苗组和对照组没有显著性差异（在延长随访研究阶段戊肝肝炎患者表现出的具体临产特征将在表S2、S3中体现）。在实验室检查结果上，虽然两组间患者抗体的亲和力在肝炎急性期有存在不同，但是整体结果大体相似。疫苗组受试者有更高亲和力的抗体，这一发现与致敏后再次激起体内回忆性免疫应答的原理相一致；相反的，对照组抗体的亲和力就较低，此现象符合其前期没有致敏的表现（见图S2、表S4）。我们对其中29位感染者体内的病毒株进行测序，发现26人感染HEV-4型戊肝病毒、3人感染HEV-1型戊肝病毒。故通过54个月的研究结果分析可得戊肝疫苗有显著的疗效意义（表2），而且在延长随访中疫苗疗效并没有下降。具体疫苗有效性结果如下：符合方案集分析93.3%（95%CI，78.6-97.9）、意向性治疗分析85.1%（95%CI，67.1-93.3）、优化性意向性治疗分析86.8%（95%CI，71.0-94.0）。

　在指定的时间内两个研究组的累积发病率通过如下方法计算：累计病例数÷风险者的累积随访时间×10000。风险数量通过以下方法计算：参与者纳入研究的初始数量?（累积病例数+随后退出研究的累积数量）。

　免疫原性我们记录患者疫苗注射前后HEV-IgG抗体几何平均数浓度和血清反应阳性率，并根据患者免疫状态描绘于图3。如图所示，对疫苗组5567位参与者进行免疫原性评估。疫苗注射前52%的人血清反应为阴性（即基线血清反应为阴性），且他们中99%的人在接受疫苗注射发生血清阳转。87%的基线血清反应为阴性者在注射3个剂量的戊肝疫苗后能够维持血清反应阳性直至54个月末（表S5）。研究还发现，无论是接受1个剂量、2个剂量，还是接受3个剂量的戊肝疫苗，血清阳转率相似。但是从7-43个月的抗体水平来看，注射戊肝疫苗剂量越多，其抗体水平越高（既呈正相关）。此外，基线血清反应阳性者在注射1个剂量的戊肝疫苗后抗体浓度明显增加（图3）。

　Figure 3. HEV-IgG抗体的几何平均浓度和血清反应阳性率在计算几何平均浓度时，我们设置血清反应阴性的样本为0.04WU/ml（虚线所示）

　安全性研究过程中，疫苗组和对照组发生严重不良事件的次数相似（见表S6、S7），而且没有证据表明严重不良事件的发生与戊肝疫苗相关或可能相关。

　讨论研究表明戊肝疫苗能够维持长达4.5年的保护作用。接受戊肝疫苗的受试者在先前没有HEV免疫的前提下出现免疫反应，且没有重大安全隐患。同时，疫苗的疗效似乎也没有减弱的迹象。试验全程中，疫苗组初期阶段有1名突破性感染者、延长随访阶段有6名突破性感染者。我们目前还不知道突破性感染者的免疫反应情况，这使得我们无法确定抗体的保护水平具体是多少。我们曾在以前的研究中对抗体水平和亚临床戊肝感染风险之间的关系进行评估9，并估算出当抗体水平达到一个临界值时（0.077-0.25WU/ml）其能保护74%的HEV暴露者免受感染。此外，感染者在接受疫苗注射前其抗体水平就高低不等。所以，我们是否能从以上讨论得出这一结论，即在免受感染上宿主因素也许比抗体水平起到更大的作用。所有感染戊肝的参与者在急性期具有高度或中度亲和力的抗体，此现象与其前接受疫苗处理后而引起的免疫回忆反应相一致。同理，对照组感染者抗体亲和力就较低（见表S4、图S2）。以上结果表明，在某些情况下病毒能够逃脱疫苗诱导的免疫，以同样的方式它自然也能够逃避获得性免疫（前期有研究报告指出）9。疫苗是否具有长期的疗效与其诱导的免疫力能够稳定维持的时间有关。虽然疫苗诱导的抗体水平在疫苗注射后的前2年内降低较快，其后时间缓慢降低，但是大部分的疫苗组受试者在长达4.5年的随访后还能够被检测到戊肝抗体。2个剂量的乙肝疫苗诱导的抗体水平略低于3个剂量诱导的抗体水平。以前的报告表明，戊型肝炎疫苗前2个剂量疫苗注射后也能够预防疾病的感染，直到5个月后接种第3个剂量的疫苗23、25。这一发现引起人们关于在未来是否可以通过2个剂量的疫苗接种策略来预防疾病的兴趣讨论；然而，这个概念需要在专门设计的药效试验中证明。在长期的研究中，疾病监测灵敏度的波动一直是一个值得关注的问题。所以在这项研究中，监测系统涵盖了研究范围内所有的医疗站点和医院。监测数据在研究期间保持稳定（包括有肝炎样症状和ALT水平异常的患者）（附表S7）、大多数的受试者也持续生活在研究监督范围内。这些因素表明，结果测量的波动对研究分析并没有引入一个显着的偏差。目前的研究仍有几个局限性。第一、大多数的戊肝肝炎患者是受HEV-4感染所致。此疫苗对防治其它基因型戊肝病毒感染的疗效仍有待探索，但目前普遍认为，所有基因型的HEV肝炎病毒均属于同一血清型即一种HEV肝炎疫苗可以防治所有基因型的肝炎病毒的感染21。第二、定期随访评估可能会导致我们错过了一些不在评估期间内的没有就医的肝炎患者。第三、大多数的长期安全性数据是从当地的医疗保险系统采集所得，所以无法根据其它医疗系统记录的数据评估疫苗的疗效。总之，戊肝疫苗可以诱导一个持久的抗体水平并有效防治HEV感染达4.5年。