毕业论文兽医新城疫检测及基因测定

　毕 业 论 文

　题 目：新城疫RT-PCR检测和部分基因序列测定

　姓 名：

　学 院： 动物医学院

　专 业： 兽医

　班 级：

　学 号：

　指导教师：

　 年 月 日

　目 录

　中文摘要………………………………………………………………………………1

　Abstract………………………………………………………………………………2

　引言……………………………………………………………………………………3

　1 材料与方法………………………………………………………………………5

　1.1 毒株与病料 ……………………………………………………………………5

　1.2 仪器和试剂 ……………………………………………………………………5

　1.3 引物……………………………………………………………………………5

　1.4 新城疫RT-PCR检测…………………………………………………………5

　1.4.1 核酸的提取…………………………………………………………………5

　1.4.2 反转录………………………………………………………………………5

　1.4.3 扩增NDV部分基因片段…………………………………………………6

　1.5 NDV部分基因片段序列测定…………………………………………………6

　1.5.1 NDV的增殖…………………………………………………………………6

　1.5.2 NDV部分基因片段扩增…………………………………………………7

　1.5.3 回收纯化RT-PCR产物……………………………………………………7

　1.5.4 构建重组表达质粒…………………………………………………………8

　1.5.5 制备感受态细胞……………………………………………………………8

　1.5.6 转化连接产物……………………………………………………………8

　2 结果与分析……………………………………………………………………8

　2.1 新城疫RT-PCR诊断结果……………………………………………………8

　2.2 NDV基因片段的RT-PCR扩增结果…………………………………………9

　2.3 NDV部分基因片段的测序结果……………………………………………10

　3.0 讨论……………………………………………………………………………11

　4.0 结论……………………………………………………………………………14

　致谢………………………………………………………………………………15

　参考文献……………………………………………………………………………16

　新城疫RT-PCR检测和部分基因序列测定

　兽医专业

　指导教师

　摘要：应用已经建立的新城疫病毒RT-PCR快速诊断技术，对由德国卡塞蒂非生物工程有限公司提供的疑似新城疫病毒感染的禽病料进行了检测，检测结果为阳性。并对检测结果为阳性的病料进行鸡胚传代，对病毒进行增殖。从鸡胚尿囊液中通过提核酸，反转录，PCR扩增分别扩增出2段基因片段，用1%琼脂糖胶电泳分析RT-PCR产物，构建重组表达载体，转化宿主菌，然后送由姜成康新有限公司进行基因测序。序列分析显示所扩增的目的基因片段长度是2808bp和960bp，序列测定结果已经登陆到GenBank，登陆号为EU546165.2。通过GenBank的Blast比对其与JL-1和La Sota株同源性相近，从部分序列上来看属于Class II genotype II。

　关键词：新城疫；RT-PCR；临床诊断；基因测序；

　RT-PCR Detection of ND and Part Gene

　Sequence Analysis of NDV

　Student Majoring in Veterinary medicine laonanhai

　 Tutor ++

　Abstract：The rapid differential diagnosis technique for detection of NDV was used to detect a clinical sample provided by the Bioengineering Company. The positive sample was diagnosed by the gene sequencing. Extract nucleic acid from the chick embryo allantois. Through reverse transcription and PCR, two gene segments are amplified respectively. Conduct the electrophoretic analysis of RT-PCR outcome by using the agarose gel of 1%. Construct and recombine the expression vector, transform it to the host bacteria and then send to Biotechnology to conduct the genetic sequencing. Comparison of sequencing results with the NCBI database found that these two gene fragments showed no significant variation. All the sequences obtained from the NDV isolates were submitted to GenBank，the accession numbers were EU546165.2．The sequence analysis showed that the length of the gene segments amplified were 2808bp and 960bp．It is homologous to L-1 and La Sota strains. It is belonged to Class II genotype II by part gene sequencing.

　Key words: Newcastle disease；RT-PCR；clinical diagnosis；gene sequencing

　新城疫亦称作亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病。该病在临床上常呈现败血症经过，主要特征为下痢、呼吸困难、浆膜和黏膜出血、神经机能紊乱。该病因发病急、发病率高、致死率高，它的流行对养禽业往往会带来巨大经济损失。所以被国际兽疫局归到“A类烈性传染病”。近些年，虽然新城疫疫苗广泛应用于生产实践，并取得了一些效果，但是新城疫仍然对养禽业的发展构成严重威胁，并且呈现新的流行趋势，新城疫的防治工作也越来越复杂。随着预防接种在生产实践中的广泛应用，典型新城疫的毁灭性的大流行基本被控制住，但在世界局部地区仍不断有新城疫的暴发或者小范围的流行。

　新城疫病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）、副粘病毒亚科（Paramyxovirinae）、腮腺炎病毒属（Rubulavirus）。新城疫病毒粒子通常呈圆形，有囊膜，直径100-250nm。新城疫病毒为单股不分节段的负链RNA病毒，基因组由15156个核苷酸组成，含有6种基因：L、NP、HN、M、F和P，分别编码6个主要蛋白：L蛋白、NP蛋白、HN蛋白、M蛋白、F蛋白和P蛋白，其中HN蛋白和F蛋白位于囊膜表面，构成纤突，具有良好的免疫原性[1]。HN蛋白还能够与红细胞表面的受体结合而凝集红细胞，这种红细胞凝集作用可被特异性抗体所抑制。

　新城疫病毒易在9-11日龄鸡胚的尿囊腔内或绒毛尿囊膜上生长。致死鸡胚的时间和能力因毒株不同而异，所增殖的病毒滴度也受毒株的影响。强毒株常在30-72h致死鸡胚，弱毒株致死鸡胚的时间可延长至5-7d。死胚的头、颈部和肢端严重出血，羊水和尿囊液中含毒量最高且具有血凝活性[2]。新城疫病毒能在多种细胞中增殖，常用的有鸡胚成纤维细胞、鸡胚肾细胞和乳仓鼠肾细胞。新城疫病毒常在细胞培养物中形成0.5-4mm的透明或红色蚀斑。蚀斑的大小与毒株的毒力相关，产生大蚀斑的毒株毒力较强。新城疫病毒只有一种血清型。根据不同新城疫病毒毒株对鸡的致病性差异常将其分为三种类型，即缓发型毒株、中发型毒株、速发型毒株。生产中常根据3个指数，即1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）、最小致死量鸡胚平均致死时间（MDT）以及6周龄鸡静脉接种致病指数（IVPI）。新城疫病毒对日光、高温及消毒剂的抵抗力不强，一般消毒剂的常用浓度即可很快将其杀灭。

　自然条件下，本病主要发生在鸡、火鸡和鸽，鹅、鹌鹑、鸵鸟等也见有发病报道。本病也能感染人，引起急性结膜炎、发热、头痛等。本病一年四季均可发生，但在冬春季发生率较高。本病的传染源主要是病鸡和带毒鸡。病禽在症状出现前即可通过口鼻粘膜分泌物、粪便向外界排毒，常在症状消失后5-7天停止向外界排毒。本病的传播途径主要经呼吸道和消化道，其次是眼结膜，也可经外伤及交配传染。新城疫自然感染的潜伏期一般为3-5d，人工感染的潜伏期一般为36-72h。由于病毒的毒力和禽的种类的不同，其临床症状也有差异。最急性型是指在免疫力较低的鸡群中感染强毒株所引起的嗜脑肺型和嗜内脏型新城疫。感染鸡群可能在没有任何征兆的前提下出现个别鸡只的突然死亡。急性型新城疫初见体温升高43-44℃、精神沉郁、食欲减退或废绝、嗜睡、呼吸困难、张口呼吸、嗉囊积液有波动感，倒提病鸡时有大量酸臭液体从口中流出；病鸡常见下痢，粪便稀薄，呈黄白色或黄绿色。死亡数量呈直线上升，死亡高峰明显；随后可见病鸡出现神经症状如各种扭屈姿势，共济失调而转圈、前冲和后退等。成年鸡发病时还可见产蛋量急剧下降，蛋壳褪色，软壳蛋的数量较发病前明显增多。慢性型新城疫主要发生在免疫鸡群、本病常发的鸡场和有母源抗体的雏鸡群。慢性型新城疫临床症状不明显、发病率不高、病理变化不明显，死亡率低。病鸡往往表现有呼吸困难，病程稍长会出现头颈歪斜、站立不稳、转圈等神经症状。成年蛋鸡会出现产蛋率下降，软壳蛋增多，蛋壳退色[3]。病理变化主要表现为多种组织器官的出血和坏死。出血主要见于呼吸道、消化道黏膜，浆膜，如喉头，气管，腺胃、小肠、直肠黏膜。肠道黏膜面常见有枣核形坏死区，略突出于黏膜表面，盲肠扁桃体肿大、坏死、溃疡。成年鸡除上述可见变化外，还可见卵巢充血、出血[4]。

　对于典型的新城疫一般根据鸡群免疫接种情况，疾病的流行特点，发病鸡只的临床症状及病理变化特征等可以作出初步诊断。对于非典型的新城疫通常进行实验室确诊如病毒分离鉴定和血清学试验。病毒分离鉴定主要通过采取病变明显的肺、脾、脑等组织器官，也可用棉拭子从气管和泄殖腔取样，经常规无菌处理后通过尿囊腔途径接种9-11日龄的SPF鸡胚，收获的尿囊液可以用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验进行鉴定[5]。新城疫病毒的实验室诊断还可以根据新城疫病毒共同的保守序列设计引物，通过反转录酶—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术特异性地扩增这些毒株相应的cDNA片段作为其检测的方法。RT-PCR方法应用于新城疫的检测是近些年发展比较快的一项新检测方法，RT-PCR是在PCR技术的基础之上加入逆转录酶和DNA聚合酶一步完成RNA体外扩增方法，该方法具有快速、灵敏、特异、简便等优点[6]。只需一个RT-PCR反应即可在短时间内直接从不同禽类病料中检测出是否含有新城疫病毒，同时判断是强毒还是弱毒，无需其他辅助手段[7]。

　1 材料与方法

　1.1 毒株与病料

　鸡病料由德国卡塞蒂非生物工程有限公司提供。

　1.2 仪器和试剂

　PCR扩增仪（LongGene MG96G），DYY-31CA型水平琼脂糖电泳槽（北京六一仪器厂），微量加样器10，50，200，1000μl(Eppendorf，Finnpipette)；SPF鸡胚，TapDNA聚合酶（5U/μl）、dNTPs（25μM）为姜成康新有限公司产品，琼脂糖（美国Promega公司）其他试剂均为国产分析纯级。

　1.3 引物

　引物由德国卡塞蒂非生物工程有限公司提供。

　 新城疫RT-PCR检测

　1.4.1 核酸的提取

　采集发病鸡只的气管、脑等病变组织加入灭菌生理盐水，研磨成匀浆，将研磨的鸡病料在-20℃的环境条件下反复冻融3次，在检测时取出病料，融化病料之后，取400μl的病料上清加600μl的裂解液，颠倒混匀后，加400μl的氯仿，加氯仿前先吹打几次，颠倒混匀之后，置-20℃的环境条件下沉淀约10min，以12000r/min离心10min，取离心后上清600μl，再加异丙醇800μl，颠倒混匀之后，放置于-20℃的环境条件下沉淀30min，以12000r/min离心10min，管盖的尾部要求必须朝向一致，要求向外，避免溶核算时核酸的丢失。倾倒掉上清，将管口向下倒置于先前准备好的吸水纸上停留5-10S，沿离心管的管壁加入1000μl 的75%冷乙醇（-20℃保存）冲洗1-2次，低速离心之后，将微量移液器的枪头置于核酸相反的位置用微量移液器吸出残余的液体，每个离心管吸取操作前必须换一个枪头。

　1.4.2 反转录

　反转录体系为：

　注射用水 11μl

　5×PCR Buffer（Mg2+ free） 4.0μl

　dNTP（10mmol/L） 2.0μl

　反转录酶M-MLV（200U/μl） 1.0μl

　酶抑制剂（Inh