【基质金属蛋白酶-12及其组织抑制物-1在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义】 基质金属蛋白酶抑制

　　[摘要]目的：检测基质金属蛋白酶-12(MMP-12)及其组织抑制物-1（TIMP-1）在皮肤鳞状细胞癌（SCC）中的表达并探讨其与肿瘤分化、淋巴转移的关系。方法：免疫组化法检测MMP-12及TIMP-1在20例正常皮肤组织和32例鲍温病（BD）、53例SCC患者皮损中的表达。结果：在正常人皮肤和BD患者皮损中，MMP-12不表达，TIMP-1呈弱阳性表达，而两者在皮肤SCC患者皮损中均呈弥漫表达，MMP-12在SCC患者瘤组织中表达阳性率为92.4%，在低分化组或有淋巴结转移组中的表达明显高于高分化组（P＝0.009）或无淋巴结转移组（P＝0.01）；TIMP-1在SCC患者皮损中表达阳性率为84.9%，在高分化组或无淋巴结转移组中的表达明显高于低分化组（P＝0.005）或有淋巴结转移组（P＝0.01）。结论：MMP-12、TIMP-1蛋白的表达可能与SCC的癌分化和转移有关，MMP-12高表达与TIMP-1低表达提示SCC肿瘤细胞可能有较高的侵袭潜能。
　　[关键词]鳞状细胞癌；Bowen病；巨噬细胞金属弹力酶；金属蛋白酶类组织抑制剂
　　[中图分类号]R739.5[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）02-0237-03
　　
　　Expression of matrix metalloproteinase-12 and its tissue inhibitor-1 in cutaneous squamous cell carcinoma
　　XUAN Min1,2,YANG Hui-lan1,FAN Jian-yong1,LIANG Jie1,ZHANG Ling1
　　(1.Department of Dermotology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,Guangdong,China；2.Graduate School of Nanfang Medical University,Guangzhou 510015,Guangdong,China）
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of matrix metalloproteinase-12（MMP-12）and its tissue inhibitor-1（TIMP-1）in cutaneous squamous cell carcinoma（SCC）and the relationship between the expression and tumor differentiation and lymph node metastasis.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of MMP-12 and TIMP-1 proteins on the paraffin embedded sections of 53 patients with SCC and 32 patients with BD.ResultsMMP-12 and TIMP-1 proteins were diffusely expressed in the tumor nets and mesenchymal cells around the nets,while in normal epidermis and BD MMP-12 was negative,and TIMP-1 was weakly positive. The expressive rate of MMP-12 was 92.4％,and the expression in poorly differentiated tumous or with lymph node metastasis was significantly higher than that in highly differentiated ones（P＝0.009）or without lymph node metastasis （P＝0.01）. The expressive rate of TIMP-1 was 84.9％,and the expression in highly differentiated tumous or without lymph node metastasis was significantly higher than that in poorly differentiated ones（P＝0.005）or with lymph node metastasis （P＝0.01）.ConclusionsThe expression level of MMP-12 and TIMP-1 protein correlates with the differentiation of carcinoma and lymph node metastasis.The higher expression of MMP-12 and lower expression of TIMP-1 may indicate a higher risk of the tumor invasion and metastasis.
　　Key words:squamous cell carcinoma；bowen"s disease；macrophagemetalloelastase；tissue inhibitor of metalloproteinase
　　
　　Bowen病（bowen disease BD）和皮肤鳞状细胞癌（Squamous cell carcinoma，SCC）均系起源于表皮或附属器角质形成细胞的恶性肿瘤。前者为原位癌，病变局限于表皮内，基底膜带是完整的。后者为侵袭性癌，癌组织突破基底膜带并侵入真皮。肿瘤细胞周围细胞外基质和基底膜的破坏是肿瘤发生浸润转移的重要环节，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）及其组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）在此起重要作用，其中MMP-12（又称巨噬细胞金属弹力酶，macrophage metalloelastase，MME）通过降解细胞外基质，破坏基底膜，从而促进肿瘤浸润和转移。TIMP-1特异性地与MMP-12结合，抑制其活性[1]。目前有关MMP-12与皮肤SCC的关系少见报道，本研究应用envision免疫组化法检测32例BD、53例SCC皮肤组织中MMP-12及TIMP-1的表达，探讨其与皮肤SCC浸润转移的关系。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 病例资料：选取我院2000～2010年间的鲍温病及皮肤鳞癌手术切除标本共85例，均经组织病理证实。其中BD患者32例，年龄43～85岁，平均61.25岁，男18例，女14例；皮损位于头颈部10例，四肢8例，躯干5例，外生殖器9例。SCC患者53例，年龄28～86岁，平均63.19岁，男30例，女23例；皮损位于头颈部20例，四肢14例，躯干6例，外生殖器13例；其中伴淋巴结转移者30例，无淋巴结转移着23例。高分化20例，中分化15例，低分化18例。另取我院皮肤科及外科手术切除正常皮肤20例作为对照。
　　1.2 试剂：鼠抗人多克隆抗体MMP-12、鼠抗人单克隆抗体TIMP-1及Envision试剂盒均购自广州莱德尔公司。
　　1.3 方法：采用envision二步法进行免疫组化分析。石蜡切片常规处理后，依次加入适当稀释的一抗（MMP-12、TIMP-1的工作浓度为1:100）、envision二抗，DAB显色、苏木素复染。并用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
　　1.4 结果判断标准：MMP-12与TIMP-1以胞质内出现黄色颗粒状物质为阳性，并按着色强弱分级：无着色为0，浅黄色为1，深黄色为2，棕黄色为3。着色范围为在10×40高倍镜下随机选取5个视野（每个视野计数100个细胞），计数阳性细胞所占的百分比均值：＜25%为1，25～50％为2，≥50%为3。上述两项相加为MMP-12或TIMP-1的表达强度积分：＜2为阴性（－），＜3为弱阳性（＋），3～4为阳性（＋＋），＞4为强阳性（＋＋＋）。
　　1.5 统计学分析：应用SPSS10.0软件包对免疫组化结果进行χ2检验，P＜0.05表示有显著性差异。
　　
　　2结果
　　2.1 MMP-12与TIMP-1表达分布：MMP-12在正常对照表皮中无表达，在真皮成纤维样细胞中呈弱阳性表达或无表达。BD中MMP-12只有2例弱阳性表达，主要集中在成纤维样细胞及巨噬样细胞。53例SCC患者中阳性表达49例（92.4%）；表达较弱者均匀分布于癌巢中，较强者常以癌巢中心为著，癌巢周围间质中部分巨噬样细胞、成纤维样细胞及内皮细胞亦有阳性表达。淋巴结转移灶中阳性表达强度与原发灶相似。
　　 TIMP-1在正常对照表皮中呈弱阳性表达，主要表达于颗粒层和棘细胞层，真皮层中成纤维样细胞、单一核细胞可见阳性染色。32例BD表皮全层均有TIMP-1表达，以颗粒层和棘细胞层为主，真皮层中成纤维样细胞、血管内皮细胞、单一核细胞等可见阳性染色。53例SCC患者中TIMP-1阳性表达45例（84.9%），其在高分化鳞癌的癌巢中央表达较强，而在低分化者中呈弥漫性分布，癌旁间质中梭形纤维样细胞、血管内皮细胞等部分见阳性染色。如图1～4。
　　2.2 MMP-12、TIMP-1表达与鳞癌分化及转移的关系：MMP-12蛋白的表达在SCC组高于BD组，而TIMP-1蛋白在两组之间的表达则相反，MMP-12蛋白在低分化鳞癌或有淋巴结转移组中的表达明显高于高分化或无淋巴结转移组，TIMP-1蛋白在高分化鳞癌或无淋巴结转移组中的表达明显高于低分化或有淋巴结转移组（表1）。
　　
　　3讨论
　　肿瘤细胞周围细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）的破坏是癌细胞发生浸润转移的关键步骤。MMPs是一组高度依赖锌离子的蛋白水解酶，能降解细胞外基质和基底膜成分，破坏局部组织结构、增加肿瘤诱导的血管形成，故其在肿瘤发展和侵袭的各个阶段均起重要作用[2]。TIMP是MMP表达的最重要调节因子，具有抗血管形成及调节MMP活性的作用，从而抑制肿瘤侵袭与转移。在正常情况下，MMP和TIMP在体内保持相对平衡状态，恶性肿瘤组织中，MMPs高表达程度往往高于TIMP，趋向有利于ECM降解，且失去可调控性。MMP-12是MMPs家族中的一员，又称巨噬细胞金属弹性酶（HME），由活化的巨噬细胞和肿瘤细胞分泌，能够降解多种细胞外及非细胞外成分，弹性蛋白是其主要底物，一方面它通过分解纤溶酶原和Ⅴ型、Ⅹ Ⅲ型胶原，产生血管抑素和内抑素，抑制血管生成，抑制肿瘤的生长和侵袭[3],另一方面,它还能分解细胞外基质结构成分，如Ⅳ型胶原和纤维蛋白，促进血管生成，促进肿瘤侵袭和转移[4]，故MMP-12被认为在肿瘤发展上起双向作用。
　　本研究结果显示，正常皮肤几乎不表达MMP-12蛋白，只在真皮浅层部分梭状细胞呈弱表达。个别BD病表达MMP-12亦是在巨噬细胞中偶见，而非肿瘤细胞。在SCC中MMP-12主要表达于肿瘤细胞，其次表达于巨噬细胞及成纤维样细胞，并且表达MMP-12的巨噬细胞主要分布于癌巢边缘，这与Erja[5]等报道的研究结果相似。MMP-12在低分化鳞癌中的表达明显高于高分化者（P=0.009），在有淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组（P=0.01）。结果提示低分化鳞癌可产生较多的MMP-12来降解细胞外基质，有助于肿瘤的侵袭和转移。TIMP-1作为MMP-12蛋白表达的重要调节因子，可选择性地与MMP-12形成复合物，抑制其水解活性。本研究发现TIMP-1在低分化鳞癌中的表达低于于高分化者（P=0.005），在有淋巴结转移组的表达低于无淋巴结转移组（P=0.01），提示TIMP-1表达随鳞癌分化程度降低而减少，伴有淋巴结转移者表达强度较弱。MMP-12及TIMP-1伴随肿瘤分化程度和有无转移呈反方向变化，说明虽然两者在肿瘤组织中表达均增多，但MMP-12较其抑制因子表达的更多，显示出蛋白酶的优势状态，导致两者比例失衡，肿瘤向着侵袭转移的方向发展。
　　已有研究表明部分MMPs，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等与皮肤鳞癌局部侵袭、淋巴结转移和远处转移关系密切[6]，MMP-12能够诱导MMP-2、 MMP-3、MMP-9表达[7],引起 MMP-12水解的较为复杂的瀑布式级联激活反应。目前已证实MMP-1、MMP-9的转录需要启动子激活蛋白AP-1的诱导方可进行，而AP-1恰恰是MMP-12启动子区的重要结构[8]，说明MMP-12可能为以上多种MMPs激活的前驱因子。另外在日光性皮肤损伤的变性弹性纤维中，随着紫外线强度的增加[9]，MMP-12表达上调，同时促进变性物质的积累，增加其破坏作用，提示MMP-12与皮肤光老化形成机制密切相关，这可能亦是日光性损伤导致BD病和皮肤鳞癌发病的重要因素之一[10]。
　　综上所述，MMP-12、TIMP-1与皮肤SCC组织分化程度和浸润转移密切相关，MMP-12的高表达及其与TIMP-1比例失衡，可能是早期判断皮肤鳞癌转移和侵袭性的一个有价值的指标，但MMP-12激活调节其他MMPs活性的作用机理，及与SCC患者预后的关系尚需进一步研究。
　　[参考文献]
　　[1]Dumas V,Kanitakis J,Charvat S,et al. Expression of basement membrane antigens and matrix metalloproteinases 2 and 9 in cutaneous basaland squamous cell carcinomas[J].Anticancer Res,1999,19(4B):2929-2938.
　　[2]Kerkela E, Alaaho R, Lohi J,et al.Differential patterns of stromelysin-2 (MMP-10) and MT1-MMP (MMP-14) expression in epithelial skin cancers[J]. Br J Cancer,2001,84:659-669.
　　[3]Egeblad M,Werb Z.New functions for the matrixmetalloproteinases in cancer progression [J].Nat Rev Cancer,2002,2(3):161-174.
　　[4]Bradbury PA,Zhai R,Hopkins J.Matrix metalloproteinase 1,3 and 12 polymorphisms and esophageal adenocarcinoma risk and prognosis[J]. Carcinogenesis,2009,30(5):793-798.
　　[5]Kerkely E,Alaaho R,Jeskanen L,et al.Expression of human macrophage metalloelastase (MMP12) by tumor cells in skin cancer[J].J Invest Dermatol,2000,114(6):1113-1119.
　　[6]马泽�,樊翌明.皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌基质金属蛋白酶表达及其与肿瘤转移的关系[J].国外医学皮肤性病学分册,2004,30(3):176-177.
　　[7]Lanone S,Zheng T,Zhu Z,et al.Overlapping and enzymespecific contributions of matrix metalloproteinases 9 and 12 in IL-13 induced inflammation and remodeling[J].J Clin Invest,2002,110(4):463.
　　[8]Yu Y,Chiba Y,Sakai H,et al . Possible involvements of nuclear factor-kappa B and activator protein-1 in the tumor necrosis factor-alpha-induced upregulation of matrix metalloproteinase-12 in human alveolar epithelial A549 cell line[J]. J Pharmacol Sci,2010，112(1):83-88.
　　[9]Mizobe Y,Oikawa D,Tsuyama S,et al. mRNA expression of lysyl oxidase and matrix metalloproteinase-12 in mouseskin[J].Biosci Biotechnol Biochem,2008,72(11):3067-3070.
　　[10]Chung JH,Seo JY,Lee MK,et al. Ultraviolet modulation of human macrophage metalloelastase in human skin in vivo[J].J Invest Dermatol,2002,119(2):507-512.
　　
　　[收稿日期]2010-10-18 [修回日期]2010-12-29
　　编辑/张惠娟