同种异体软骨移植免疫排斥反应的研究进展_同种异体移植排斥反应

　　关节炎、颞颌关节疾病及关节机械损伤以及颌面部美容整形的发展，都使得软骨治疗成为倍受关注的对象，由于软骨组织中无血管、神经及淋巴等供应，而软骨细胞又为终末分化细胞，软骨缺损很难自身修复，故治疗以软骨移植为主。软骨移植包括自体、同种异体、异种移植，其中自体软骨移植来源有限、给患者带来二次创伤并增加患者疼痛而致应用受限，异种移植由于强烈的免疫排斥等问题研究还处在基础实验阶段，而同种异体软骨移植来源广泛，生物学性能良好，可望成为较理想的软骨移植物，但其存在的免疫排斥反应影响移植物在体内的长期存活，是目前研究不容忽视的问题[1]。
　　
　　1免疫原性来源
　　
　　1.1软骨细胞表面的主要组织相容性抗原（MHC）：软骨细胞同其他有核细胞一样表面也表达MHC I类分子[2]，供者和受者细胞间MHC分子不匹配所诱发的细胞和抗体介导的细胞毒反应是引起同种异体软骨移植免疫反应的关键[3]。许多学者在人或猪的软骨组织实验研究中表明：软骨细胞只表达MHC I类分子，而不表达MHC II，但与γ-干扰素（IFN-γ）共培养诱导后可表达MHC II，进而发挥类似抗原提呈细胞的功能，促进免疫排斥反应[4-5]。 Romaniuk等[6]进行了兔同种异体骺软骨细胞移植研究，发现1周后移植物周围有大量MHC II+细胞、CD4+细胞及单核/巨噬细胞浸润，这可能也是由于MHC I类分子激发同种异体淋巴细胞活化，分泌IFN-γ进而诱导所致。
　　1.2软骨细胞特异性分化抗原（CSDA）：Langer等[7]通过分析白细胞游走试验发现，大鼠经同基因软骨细胞注射或软骨刨削后可发生自身反应，首次证实了软骨细胞特异分化抗原(CSDA)的存在。Moskalewski 等[8]在同种异体软骨移植的大鼠模型研究中发现，间期接受2～3次大鼠软骨细胞移植的兔血清中含有高滴度的抗软骨细胞的细胞毒抗体，同时对新鲜或培养24h的软骨细胞溶胞产物Western blot蛋白分析中检测到了一种抗原，而在成纤维细胞及内皮细胞中未检测到，表明软骨细胞特异性抗原在移植免疫中发挥了重要作用。Phipatanakul等[9]在进行新鲜异体骨软骨移植的研究中也检测到移植物软骨特殊蛋白抗原的存在。
　　1.3软骨细胞外基质（ECM）：软骨组织由丰富的细胞外基质和少量软骨细胞组成，ECM将软骨细胞包裹在软骨陷窝内，隔绝了软骨细胞与宿主免疫原性分子的相互接触，形成免疫屏障，预防或延缓了同种异体软骨移植的免疫排斥反应[10-11]。软骨基质主要由II型胶原和多聚蛋白聚糖(aggrecan)组成，蛋白多糖中的核心蛋白具有抗原性，但被其周围无抗原性的酸性糖胺多糖所遮盖，致使其不具有抗原性[12]，这在提取硫酸软骨素体外免疫实验中亦得以证实。对于II型胶原，有学者研究指出其存在抗原性，且是一种T细胞依赖性的抗原，在软骨组织工程中应考虑其抗原性[13]。但由于II型胶原抗原性非常弱，目前的软骨异体移植研究中几乎都未将胶原的抗原性考虑在内。
　　1.4 免疫细胞及相关组分：自然杀伤细胞（NK）对正常的软骨细胞具有自发的细胞毒效应，Anna Romaniuk等[8]在大鼠同种异体软骨移植研究中指出，CD8+是参与移植软骨直接破坏的重要细胞，而CD8标记物在NK细胞上也有分布，表明NK细胞对移植的软骨细胞也有杀伤作用。而树突状细胞（DC）的抗原提呈作用，单核细胞、巨噬细胞以及少许非主要组织相容性抗原等在软骨移植中均发挥了重要作用。
　　1.5 其他：Osiecka-Iwan等[14]研究使用TLCK和胶原酶处理的软骨细胞与脾细胞混合培养，结果显示加TLCK处理组并未引起脾细胞的刺激作用，而未加TLCK组却相反，说明在软骨分离时所用的II型胶原酶是致免疫源，而该酶在软骨细胞中的残留也是软骨移植免疫反应的一个来源。另外，基础实验中缺损模型的制备方法以及所选动物的近交程度均对软骨移植的免疫排斥有影响。
　　
　　2软骨免疫反应机制
　　
　　软骨细胞表达主要组织相容性抗原(MHC)I类分子，有些动物还表达MHC II 类分子，如兔和小鼠[15]。而人和猪只表达I类，受体和供体的MHC分子不匹配所诱导的T细胞介导的细胞毒反应是同种异体软骨移植发生免疫排斥反应的关键。
　　软骨移植免疫反应发生的途径包括：①CD8+ T细胞即杀伤T细胞(Tc)识别MHC I类分子而引起的对靶细胞的直接杀伤作用；②NK细胞对异体细胞的杀伤作用；③诱导性的MHC II分子-CD4+ T细胞间接识别免疫途径；④树突状细胞(DC)对靶细胞的作用，即抗原提呈作用。而在整个免疫排斥反应中淋巴细胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等发挥了重要作用。
　　同种异体软骨移植后，移植物外周暴露的软骨细胞上的MHC I分子被受体CD8+T细胞识别，并与其表面受体(TCR)结合，进而激活Tc细胞，活化的Tc细胞会释放胞浆内颗粒：穿孔素(peiforin)和颗粒酶(granzyme)，前者在靶细胞膜上穿孔，后者是胰蛋白酶或糜蛋白酶类物质，它们对靶细胞的杀伤作用很快，使软骨细胞在数分钟内迅速被溶解；同时它释放的效应分子可活化靶细胞内核酸酶，破坏靶细胞的DNA，从而诱导软骨细胞凋亡；另外，活化的Tc还表达配体Fasl，它可与靶细胞上的受体Fas分子（又称CD95）结合，促使靶细胞凋亡，而T细胞表面也表达有Fas，故Tc活化后也可杀死自身或相邻表达Fas的T细胞，即为活化诱导的细胞死亡，此过程对免疫应答的负调节或维持自身耐受很重要。
　　Tc细胞活化后还会释放细胞因子如IFN-γ、TNF-β等。IFN-γ可刺激抗原提呈细胞（APC）表达MHC II类分子，进而被宿主的CD4+T细胞所识别，促进Th1/Th2活化，释放IL-2等因子，引起更强烈的免疫排斥反应。柳子星等[16]将IFN-γ与软骨细胞共培养后发现软骨细胞可表达MHC II类分子，使其发挥类似抗原提呈细胞(APC)功能，这进一步证实了IFN-γ的刺激作用，并说明软骨细胞移植后还诱导了MHC II类分子表达，从而激活了MHC II分子-CD4+T细胞免疫反应途径。同时IFN-γ还具有增强NK细胞的细胞毒活性，促进CTL成熟等特点。
　　正常情况下，MHC I类分子和KIR(NK细胞的抑制性受体)相结合，有效阻止了NK对自身正常组织的攻击，但KIR不能识别同种异基因或异种细胞的MHC I类分子，故在同种异体软骨移植中无法转导负向调节信号，致使NK细胞处于激活状态 ，从而杀伤异体软骨细胞。另外由T细胞介导的免疫反应中所释放的细胞因子如IFN-γ和IL-2均可进一步增强NK细胞的细胞毒活性。
　　
　　3免疫反应的处理
　　
　　同种异体软骨移植后有较强的免疫排斥反应，为了维持软骨移植后的稳定，目前降低异体软骨移植免疫排斥反应的方法主要有以下几种：
　　3.1 MHC分子的配型：Stevenson 等[17]在犬的同种异体软骨移植实验中，对软骨细胞的MHC配型或不配型的对比研究发现，不配型移植组较配型移植组免疫反应严重，有学者主张建立软骨细胞库，以便为软骨移植提供合适的供体。
　　3.2 基因转染技术：曹谊林等[18]应用FasL-pLNCX2基因重组逆转录病毒载体转染猪的软骨细胞，使FasL基因转入猪的软骨细胞中并有效表达，首先在体外证实了FasL+软骨细胞能有效杀伤Fas靶细胞，应用该细胞构建的组织工程软骨进行同种异体移植的进一步研究表明， FasL+软骨细胞在体内可形成软骨组织，且移植物局部免疫反应有所降低，表明该技术有利于发挥抑制免疫反应的作用。
　　3.3免疫抑制剂的应用：为了克服免疫排斥反应，许多学者还尝试像器官移植一样采用免疫抑制剂来处理。Osiecka-Iwan 等[14]在大鼠同种异基因软骨移植后，应用环孢霉素A和克拉屈滨药物处理，移植5周后观察脾细胞－软骨细胞混合培养中脾单核细胞(SMC)的刺激作用，发现单纯同种异体移植者SMC刺激作用强烈，联合应用免疫抑制剂者则无刺激作用，表明免疫抑制剂可抑制异体软骨移植的免疫排斥反应，且对全身反应的作用较局部反应更为明显。
　　3.4 深低温冻存：深低温冻存尤其是程序性降温可明显地减轻软骨细胞抗原性，从而预防性地降低移植后的免疫排斥反应[19]，该现象可能的解释有：①低温冷冻选择性去除或减少了过路淋巴细胞，或丧失了对过路淋巴细胞的免疫刺激能力，从而导致了抗原性降低；②深低温冻存降低了移植软骨树突状细胞的数量和功能，减少了抗原提呈作用[20]。但该方法会影响细胞的活力，Acosta 等[21]研究表明，冰冻较4℃保存相比，尽管可以提供更多数量的活细胞，但成冰作用的坏死、渗透性的改变以及凋亡过程等都直接降低了细胞活力，并且导致炎性物质的释放和基质金属蛋白酶（MMP）的表达。
　　3.5钴60(Co60)照射处理：有学者报道术前应用Co60照射肋软骨，可降低同种异体肋软骨的抗原性，减轻炎症反应，减少软骨吸收[22]。
　　另外，还有一些方法可不同程度地降低软骨的免疫原性。张晨等[23]报道采用低渗的Triton X-100为主的脱细胞方法脱去人耳软骨细胞，使人耳软骨抗MHC I反应由阳性转为阴性，有效地去除了移植物的抗原性。此外，软骨细胞在分离和体外培养过程中酶消化也可能造成膜受体丢失，从而降低了细胞的抗原性[24]。
　　
　　4展望
　　
　　软骨移植免疫反应降低或预防措施目前取得了一定的成效，但尚无理想的方法，且多是通过纯粹的免疫学途径来进行干预。众所周知，软骨移植物的破坏及排斥反应的发生主要是由于细胞外基质降解致软骨细胞暴露，进而细胞膜表面的MHC分子与宿主免疫性物质相接触所引起[11]。据此推想，今后的研究是否可以从基质降解的始动环节入手，通过抑制负责基质降解的酶来保持基质的完整性，发挥其免疫屏障作用，以降低软骨移植的免疫排斥反应，从而保持软骨移植物在体内的长期存活。
　　
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　　[收稿日期]2007-12-19 [修回日期]2008-02-20
　　编辑/李阳利
　　
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