人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达:骨髓间充质干细胞诱导分化培养基

　　[摘要]目的： 系统研究人骨髓间充质干细胞（ hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
　　[关键词]人骨髓间充质干细胞；体外分化；成骨相关基因；表达模式
　　[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0588-04
　　
　　Kinetic expression pattern of osteogenic genes during in vitro osteogenesis of human bone mesenchymal stem cells
　　WU Huan-huan,GONG Fu-xing,WANG Qian,CAO Yi-lin,XIAO Ran
　　(Research Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing 100144,China)
　　
　　Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.
　　Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern
　　
　　骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。临床常用自体骨和人工材料修复骨缺损，但应用受到自体骨来源有限、供区损伤大、人工材料组织相容性差等缺点的制约，组织工程骨为临床修复骨缺损提供了新的方案。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有可多向分化、体外扩增能力强、来源广泛、取材方便、对机体损伤小等优点，已成为骨组织工程研究目前最常用的种子细胞[1-2]。
　　现已明确[3-5]可通过体外诱导（如BMP2，维生素D，地塞米松等）使BMSCs定向分化为成骨细胞。本实验用RT-PCR法系统研究hBMSCs在体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因表达，并参考正常成骨细胞分化周期[6-8]进行分析，希望为基于BMSCs的骨组织工程研究提供参考。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 hBMSCs的来源：成人骨髓血样本5例，取自中国医学科学院整形外科医院5例先天齿槽嵴裂患者。5例经血、尿分析及系统检查无代谢性骨病，无造血系统疾病，肝功能正常。术前经医院伦理委员会及患者同意，手术中取髂骨移植时取骨髓血5ml，吸入预先加有0.5ml肝素的无菌针管中备用。
　　1.2 主要试剂及仪器：Ficoll分离液（G&E公司，瑞士）；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素（HYCLONE公司，美国）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、茜素红、油红O（Sigma，美国）；NRaseA、Trizol、PI(Invitrogen，美国)；RT-PCR Kits (Invitrogen，美国)；流式抗体CD34-PE、CD44-PE、CD90-FIT C、CD45-FITC、PE和FITC同型对照（Bioscience公司，美国），培养皿（Corning，美国），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）
　　1.3 hBMSCs的分离纯化、扩增：采用密度梯度离心法[9]分离hBMSCs，将抽取的骨髓血置于Ficoll液上层，2 500r/min离心20min后，吸取中层的云雾状有核细胞层，DMEM液洗涤，1 500r/min，离心5min，弃上清。将分离得到的单核细胞转移至35mm的无菌培养皿中，加入足量完全培养基（含10%胎牛血清，1%青链霉素）置于37℃，5% CO2孵箱中培养。培养48h后半量换液，以后每3天换液一次。原代克隆成熟后，用0.25%胰蛋白酶消化，待细胞变圆浮起时，用完全培养基终止消化，1 000r/min，离心5min，弃上清，加入5ml完全培养基，反复吹打制成单细胞悬液，接种于35mm无菌培养皿中，此为第1代细胞（P1），每3天换液一次。待P1代细胞长到80%～90%汇合时，用上述的方法消化传代，再以5×103cells/cm2的接种密度接种到无菌培养皿中，此为第2代细胞（P2），每3天换液一次。用倒置显微镜观察hBMSCs的形态变化及生长情况。
　　1.4 hBMSCs的鉴定
　　1.4.1 hBMSCs的细胞周期检测：取2代hBMSCs经过0.25%胰酶消化离心(1 000r/5min)，细胞计数并重悬，然后调整细胞浓度至1×106/ml，用70%的酒精固定24h，用NRaseA处理30min，碘化丙啶(Pl)染色10min。流式细胞仪检测并分析分析细胞周期。
　　1.4.2 hBMSCs的表面抗原表达检测：取2代hBMSCs经过0.25%胰酶消化离心(1 000r/5min)，细胞计数并重悬，然后调整细胞浓度至1×106/ml，按Bioscience抗体说明书操作标记CD34-PE、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-FITC，用Accuri C6流式细胞仪检测表面标志物的表达,利用小鼠FITC IgG1-Is otype，PE IgG1 -Isotype 和空白作为对照。
　　1.4.3 hBMSCs的多向诱导分化：①成脂诱导：取2代hBMS Cs，以1×104cells/cm2接种到6孔板中，每孔加入2ml成脂诱导培养基[10-11]（0.5μM氢化可的松， 0.5μM IBMX，60μM 消炎痛，10μg/ml 胰岛素）；诱导10天后，钙-福尔马林固定细胞，0.1mol/L的PBS轻洗3遍，60%异丙醇处理2min，加入油红O染液摇床振洗30min，70%酒精调整颜色，镜下观察；②成骨诱导：取2代hBMSCs，以3×103cells/cm2接种到6孔板中，每孔加入2ml成骨诱导培养基[12]（10-8mmol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C）。每2～3天视情况换液。诱导21天后，4%多聚甲醛固定细胞，0.1mol/L的PBS轻洗3遍，浸于茜素红染液中摇床振洗30～60min，三蒸水清洗数秒。
　　1.5 hBMSCs体外成骨诱导分化的成骨相关基因半定量RT-PCR检测：取2代hBMSCs，以3×103cells/cm2接种到6孔板中，每孔加入2ml成骨诱导培养基，每2～3天换液。在体外成骨诱导的第3天，第7天，第14天，第21天采集样本，以未诱导的hBMSCs作为阴性对照。
　　1.5.1 引物设计：利用GeneRuner 1.0软件，根据Genebank提供的COL1A1、ALK、RUNX2、BMP2、COL XVA1、BSP、Osterix（OSX）、OCN、OPN、内参照18s mRNA基因序列设计10对引物（引物序列见表1）。
　　1.5.2 RNA提取：按照Trizol操作说明书提取样本总RNA，最后加入适量0.1%DEPC・H20溶解RNA。紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，置于-80℃保存备用。
　　1.5.3 反转录及PCR反应：按照invitrogen试剂说明书反应体系条件进行实验，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
　　
　　2结果
　　2.1 hBMSCs的分离培养：接种后48h，极少细胞贴壁，贴壁细胞呈梭形。4天后可见细胞呈成纤维细胞样集落生长(CFU-F)。大约5～10天，细胞生长迅速并形成大克隆(图1A)。
　　2.2 hBMSCs的鉴定
　　2.2.1 hBMSCs的细胞周期：流式细胞周期分析表明：G0/G1、S和G2/M的细胞所占的比例分别为88.4%、4.55%和7.06%，提示大部分细胞处于G0/G1期，仅仅少数细胞处于活跃的增殖期，与干细胞的细胞周期特性一致[13](图1B)。
　　2.2.2 hBMSCs的表面抗原表达：流式细胞仪检测结果显示hBMSCs表达间充质干细胞标志物CD44、CD90（>95%），不表达造血干细胞标志物CD34、CD45（ 　　[2]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.
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　　[收稿日期]2010-11-15 [修回日期]2011-02-12
　　编辑/张惠娟