牙周膜成纤维细胞【rhBMP2作用下人牙周膜成纤维细胞中cbfα1的表达研究】

　　[摘要]目的：本实验通过反转录聚合酶链反应，测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2（rhBMP2）对人牙周膜成纤维细胞中cbfα1mRNA在不同作用时间点表达，了解rhBMP2对骨改建过程的调控。方法：原代培养人牙周膜成纤维细胞，取生长良好的第6代细胞，分别用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于细胞，于作用1、3、5、7天后收集细胞。反转录聚合酶链反应检测各组细胞4个时间作用点cbfα1 mRNA含量，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Image Pro Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析。结果：不同浓度rhBMP2对cbfα1mRNA的表达均表现为初期降低，而后明显增高，至峰值后回落。不同浓度对cbfα1 mRNA表达上调的峰值没有明显差异。100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2浓度组能够较快地上调cbfα1mRNA表达至峰值，然后100ng/ml组表现为缓慢下降，50ng/ml组迅速回落；25ng/ml组较慢上调cbfα1mRNA的表达至峰值后，迅速回落。结论：①根据实验各组中cbfα1的表达变化，提示笔者BMP2可以上调HPDLfs中cbfα1的转录水平，并且对cbfα1的表达调控主要为启动作用，cbfα1的表达增高幅度似乎与rhBMP2浓度并不相关。②高浓度组对cbfα1的上调作用迅速而持久，低浓度组的作用则相对迟缓而短暂。提示笔者BMP2可能通过上调cbfα1的表达而促进HPDLfs向成骨细胞转化。
　　[关键词]牙周膜成纤维细胞；rhBMP2；cbfα1
　　[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2001）06-0965-04
　　
　　Study on the expression variety of cbfα1 in human periodontal ligament fibroblasts with rhBMP2 reaction
　　JI Ling-ling1,ZHOU Hong1,LI Ang2，RAO Guo-zhou2
　　(1.Department of Orthodontics,Stomatological Hospital of Xi"an Jiaotong University,Xi"an 710004,Shaanxi,China;2.Medicine Research Center ofStomatology,Xi"an Jiaotong University)
　　
　　Abstract:ObjectiveBy RT-PCR to investigating the effects of rhBMPs in different concentration on the expression of cbfα1 in human periodontal ligament fibroblasts.To clarify the molecular mechanism of BMPs" regulation to the HPDLfs,which contribute to the bone rebuilding. Methods The 6th generation well-grown primary culture fibrocyte from HPDLfs were used in the experiment.The cells were subjected to different doses ofrhBMP2(25ng/ml,50ng/ml and 100ng/ml) for 1,3,5,7 days in this experiment.mRNA expression of cbfα1 were determined by semiquantitative RT-PCR approach.electrophoresis tape brightness was analyzed by graphical analysis software Image Pro Plus5.0.Results The expression of cbfα1mRNA acted by each rhBMP2 of different concentration fell down in primary stage,then increased obviously and decreased after reaching the peak value.The peak value of expression which reacted in different concentration presented no significant difference. When the expression of cbfα1mRNA regulated rapidly to peak value in both concentration 50ng/ml and 100ng/ml,the expression decreased smoothly in 100ng/ml,but decreased sharply in 50ng/ml.The expression increased smoothly and decreased sharply in 25ng/ml at the same time. Conclusion ① Based on the different expression variety of cbfα1 in experiments,the results showed that BMPs can enhance the mRNA of cbfα1 in HPDLfs and acted mainly as startup effect on the expression regulation of cbfα1. The enhanced amplitude of cbfα1 expression seemed to be no relation with the rhBMP2 concentration.②. The enhancive effect in high concentration on cbfα1 was quick and abiding,but it was slow and unabiding in low concentration.
　　Key words:human periodontal ligament fibroblasts;rhBMP2;cbfα1
　　
　　牙齿受力后牙周膜成纤维细胞是最先接受该机械信号的细胞，通过一系列信号传导诱发成骨细胞、破骨细胞等一系列细胞的分化，引起牙周组织改建，牙齿得以移动。而BMPs是这一型号通路中的重要细胞因子，可以促进HPDLfs向成骨细胞转化并参与组织改建[1]。核心结合因子（cbfα1）是近年来发现的未分化间充质细胞向成骨细胞转化的特异性转录因子，一些研究表明其可能参与了正畸牙齿移动过程中的牙周组织改建[2]。本实验通过观察不同浓度重组人骨形成蛋2（rhBMP2）不同作用时间下HPDLfs中cbfα1mRNA表达的变化，探讨BMPs促进HPDLfs成骨分化的可能分子机制，以及与cbfα1的关系。
　　1材料和方法
　　1.1 主要试剂及仪器：Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Gibco公司），ABC免疫组化试剂盒（Vector，USA波形丝蛋白抗体，角蛋白抗体,rhBMP2（第四军医大学生化教研室），总RNA提取试剂盒TRIzol Reagent（Invitrogen公司），紫外分光光度计（Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro），反转录酶M-MLV Reverse Transcriptase (200Uμl)（Promega公司），反转录缓冲液M-MLV RT 5××Reaction Buffer （Promega公司），DNTP(10mM)天为时代，DNA MARKERⅢ（天为时代）。
　　1.2 HPDLfs的体外培养及实验分组：①取材：取11～14岁因正畸矫治需要而拔除的健康年轻恒牙，采用组织块消化培养法进行培养。②无菌处理：在超净台内用含双抗的PBS从牙齿根方向冠方冲洗牙齿数次，用无菌手术刀片刮取牙根中部1/3处的牙周膜组织。③收集消化：将刮下的牙周膜组织置于PBS液中，移入离心管，离心（800r/6min），收集牙周膜组织，加入10倍体积的浓度为2%的Ⅰ胶原酶，置于CO2孵箱消化。④接种：约2h后，组织呈絮状后，离心后收集组织，弃去胶原酶，加入含10%小牛血清（FCS），100μ/ml青霉素，100μ/ml链霉素的DMEM（低糖）培养液，充分吹打细胞悬液，接种于6孔培养板。接种量为每孔接种1颗牙齿的牙周组织量。⑤孵育：置于CO2孵箱，37℃培养。3天内保持培养板静置，以利于组织贴壁。最早于第3天可见有细胞从组织块中游出。当细胞生长达到孔板的30%时，进行细胞分散后，继续培养，期间常规换液。⑥传代：待细胞覆盖孔板底达60%时，进行首次传代。传代时弃去旧培养液，加入0.25%胰蛋白酶2～3滴，以覆盖孔底为宜，室温下消化，2～3min，镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立即终止消化，弃去上清，加入2ml培养液，充分吹打制成细胞悬液，以1:1将细胞悬液移入15ml培养瓶，加入足量培养液培养。以后以1:2进行传代。免疫组化ABC法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白抗体染色，作细胞来源鉴定。
　　为检测不同浓度rhBMP2对体外HPDLfs中cbfα1mRNA表达的影响，用高压灭菌生理盐水将rhBMP2冻干粉配制成25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml 3个浓度组。各浓度组分别观察作用1、3、5、7天后，HPDLfs中cbfα1mRNA表达的变化。
　　分组设计为：对照组：HPDLfs＋2%DMEM；B1组：25ng/ml rhBMP2＋HPDLfs＋2%DMEM；B2组：50ng/ml rhBMP2＋HPDLfs＋2%DMEM；B3组：100ng/ml rhBMP2 ＋HPDLfs＋2%DMEM。
　　取4块6孔培养板，4个作用时间点各1块。各培养板为3个浓度组及相应对照组。每孔接种细胞悬液2ml，在标准环境下以含10％FCS的DMEM培养液孵育24h后，弃去培养液及未贴壁的细胞。实验组分别加入rhBMP2，终浓度为25、50、100ng/ml，含2％FCS的DMEM培养，对照组为仅含2％FCS的DMEM。作用1、3、5、7天后进行检测。
　　1.3 反转录聚合酶链反应检测cbfα1的表达
　　1.3.1细胞总RNA的提取：弃去每孔的培养液，每孔用1×PBS 2ml洗1遍，弃去PBS加入1mlTRIzol。
　　1.3.1.1溶解分离：①用移液器将细胞从孔底吹下，吹打壁上的细胞，0～15℃静止5min，移入ep管中。②加入200μl氯仿震荡15s，15～30℃度静止2～3min，离心（12 000r/15min）。
　　1.3.1.2沉淀RNA：①吸出上层水相，移入新的ep管中；②加入500μl的异丙醇，15～30℃孵育10min，2～8℃，离心（12 000r/10min），弃上清。
　　1.3.1.3洗涤：①加入1ml 70%乙醇（DEPC水配制）涡旋2～8min，离心（7 500r/5min）；②室温干燥5～10min。
　　1.3.1.4溶解：加入20μl DEPC水溶解RNA，55～60℃孵育10min。
　　1.3.1.5保存：-70℃保存备用。
　　1.3.2 反转录：紫外分光光度计定量取2μg总mRNA，加入1μg oligodT，70℃水浴10min后，立即置于冰上；加入 M-MLV 5×Buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，200U/μlM-MLVRT 1μl，42℃水浴锅中60min。
　　1.3.3 PCR扩增
　　1.3.3.1引物设计
　　①cbfa1的分子引物序列：该引物将产生333bp的cDNA片断。
　　上游引物5" GCTTCAACTGGGCCCTTTTTCAG 3"
　　下游引物5" CCATCAGCGTCAACACCATCATTC 3"
　　②β-actin分子引物序列：该引物序列由北京三博远志生物技术有限公司合成。
　　上游引物5"TCCTGTGGCATCCATGAAACT3"
　　下游引物5"AACGCAGCTCAGTAACAGTC3"
　　1.3.3.2 PCR条件：在20μl的反应体系中，模板cDNA第1条链是1μl，cbfa1引物（10pm/μl）1μl，dNTP (10mM) 2μl，Mg++(25mM) 1μl，10×PCR Buffer2ul，tag plus DNA聚合酶0.5μl加灭菌水至20μl。反应条件为94℃变性 4min，94℃30s，54.5℃30s，72℃1.5min，35个循环。
　　1.3.3.3 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用Image Pro plus5.0测定电泳条带荧光光密度值。
　　
　　2结果
　　2.1 HPDLfs的形态观察及鉴定结果：观察到所培养细胞在形态上均呈长梭形或星形，胞突细长，胞体丰满，胞浆均匀，中央有圆形或椭圆形的胞核，核仁清晰，一般有2～3个，呈成纤维细胞样（如图1）。免疫组化实验显示细胞波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证明为中胚层组织来源（如图2～3）。最初的5代细胞3～5天即可长满培养瓶底，生长状态活跃。6代以后的细胞，一般7～9天长满瓶底，细胞增值稳定。
　　2.2 各浓度组cbfα1mRNA的表达变化：不同浓度的rhBMP2作用于人牙周膜成纤维细胞，cbfα1mRNA的表达随作用时间的变化而发生变化。内对照基因β-actin为参照，各浓度组作用初期（1天）cbfα1的mRNA表达大幅度下降，当作用至3天时，各组mRNA的表达明显上升，B2、B3组mRNA的表达均在此时达到峰值，且组间无明显差异。
　　随着作用时间的延长，各组mRNA的表达变化出现差异。B1组的表达继续增高，于第5天达到峰值，且与其他两组的峰值无明显差异，继续作用，第7天时，该组mRNA的表达恢复到作用前水平；B2组mRNA的表达则在第3天达到峰值后，迅速回落，并不随作用时间的延长而继续上升，于第5天回落到作用前水平；B3组mRNA的表达则在达到峰值后，随时间的延长呈下降趋势，但与B1、B2组相比，B3组mRNA的表达下降并不明显，直至7天时，其mRNA的表达仍然高于对照组。RT-PCR凝胶成像结果如图4～6。电泳条带荧光光密度值见表1。
　　
　　3讨论
　　核心结合因子（cbfα1）是新近发现的成骨细胞分化和功能的关键因子[3]。已有研究表明[4]BMP2可以上调骨组织细胞中cbfα1mRNA，以调控其向骨系细胞分化。本实验通过RT-PCR测定不同浓度rhBMP2不同作用时间下的HPDLfs中cbfα1mRNA的表达量，发现对照组中cbfα1mRNA有微弱表达，与杨瑛[5]等研究一致。说明HPDLfs是具有类似骨祖细胞特性，在一定的条件下，可以向骨系细胞进行转化，进一步证明了HPDLfs在牙周改建中的作用。
　　3个浓度实验组，cbfα1mRNA的表达均在rhBMP2作用1天后显著降低，其后表达出现明显的增高，说明rhBMP2可以调节HPDLfs中cbfα1mRNA的表达。提示我们rhBMP2可能通过上调HPDLfs中cbfα1的转录水平，使得其向骨系细胞分化，进而使细胞有成骨型表达。这与以往rhBMP2作用HPDLfs后引起细胞ALP活性增加、OC合成上升、矿化结节形成这些成骨型表现出现的研究[6]一致，并且更进一步从基因转录水平上对BMPs作用下HPDLfs向成骨细胞分化进行了解释。
　　比较3个实验组，可以看到不同浓度组其对HPDLfs中cbfα1的转录调控并不一致。一方面，就变化趋势而言，B1（25ng/ml）和B2(50ng/ml)组均是在mRNA的表达增高达到峰值后迅速回落，而B3(100ng/ml)组则在峰值后呈现缓慢下降的趋势，直到作用7天时，mRNA的表达仍然处于较高水平。另一方面，就cbfα1mRNA表达增高达到峰值的作用时间而言，B2组和B3组一致，均在作用的3天达到峰值，B1组在作用5天后达到峰值。可见高浓度组对cbfα1上调迅速且作用持久，而低浓度组上调相对缓慢且作用时间短暂。提示我们，HPDLfs对低浓度rhBMP2的作用反应相对迟缓，且上调作用短暂；而对高浓度rhBMP2的作用反应迅速而持久。这支持了rhBMP2对HPDLfs的作用具有剂量依赖性，HPDLfs成骨型表达与BMPs作用浓度正相关的研究。推测高浓度的BMPs可能通过对cbfα1mRNA表达进行较长时间的作用，从而使HPDLfs成骨型比低浓度组表现更为显著。
　　3个浓度组对细胞cbfα1表达上调的峰值无明显差异，说明cbfα1表达上调的幅度与rhBMP2的作用浓度无关，这提示BMPs对cbfα1的表达调控更类似启动部分，完全调控cbfα1的表达还需有其他因素。
　　本实验中，各个浓度组在第1天的表达均低于对照组，对此，尚无一个明确完善的解释。推测，rhBMP2直接作用于HPDLfs后，瞬时高浓度rhBMP2打破了细胞原本的平衡，可能启动了HPDLfs胞内调节机制，存在特异的机制阻断了中间信号分子，引起cbfα1的表达下降；随着作用时间的延长，cbfα1的表达下降导致了中间信号分子转录水平的负反馈增加，而使cbfα1的表达在第3天表达升高。这与BMP2作用下人牙乳头细胞的研究相类似。
　　目前，在对于体外人牙周膜成纤维细胞cbfα1的研究主要集中在细胞加力后cbfα1的表达变化。与本实验不同的是，间歇性牵张力作用下HPDLfs中cbfα1的表达增高要迅速得多[7]，并且呈一过性反应[5]，并且猜想，cbfα1在外力作用下反应迅速而短暂，类似立即早期基因，可能在机械力诱导骨形成中起到“启动子”或“扳机点”的作用。对比不同实验模型，机械力直接作用和生物活性物质直接胞外作用，虽然都可以引起HPDLfs中cbfα1mRNA表达的增高，但显然HPDLfs对机械信号和生物活性物质这两种作用的反应性不尽相同。正畸力作用下，体内复杂环境中的HPDLfs中cbfα1究竟是通过怎样的细胞信号传导通路被激活，还需要进一步深入研究。
　　
　　4结论
　　基于实验各组中cbfα1的表达变化，提示我们BMPs可以上调HPDLfs中cbfα1的转录水平，并且对cbfα1的表达调控主要为启动作用，cbfα1的表达增高幅度似乎与rhBMP2浓度并不相关。高浓度组对cbfα1的上调作用迅速而持久，低浓度组的作用则相对迟缓而短暂。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2011-03-10[修回日期]2011-05-03
　　编辑/何志斌
　　 注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”