正畸P点 Ｐ物质缓释系统对正畸大鼠牙周破骨细胞数目的影响

　　[摘要]目的：探讨P物质纳米缓释微球的生物活性及对正畸牙周改建中破骨细胞数目变化的影响。方法：将P物质一聚乳酸一聚乙醇酸共聚物纳米缓释微球(sP―PLGA NP)注射入正畸大鼠第一磨牙根尖水平龈下，分别在加力后1，3，7，14天后采用HE染色观察牙周组织变化和压力侧破骨细胞数目，并和单纯用P物质以及空白对照组比较。结果：加力后1天，三组间牙周都未发现有破骨细胞；加后3天，破骨细胞数量表现为P物质组>缓释纳米微球组>对照组，与对照组有显著性差异(PP物质组>对照组，与对照组有显著性差异(P-1mgP物质的PBs 100ul(P物质组)；第3组：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙龈下注射100ul的PBs(对照组)。每一组中分四个亚组：加力l天组、3天组、7天组、14天组。每一亚组4只大鼠。1．2主要试剂与仪器：人P物质(substance P)(Sigma公司，USA)；自制P物质纳米粒及其冻干粉剂(图1)；速眠新(长春军需大学兽医研究所)；细金刚砂钻(登士柏公司)；正畸测力计(精确到1g，Swi ss)；正畸用螺旋弹簧(杭州新亚公司)；OLYMPUS数字显微镜(JaparO；JEM-2000EX透射电镜qaparO。1．3动物模型及标本制备：SD雄性大鼠，体重(180±20)g(7～9周)。加力装置采用结扎丝将一根镍钛螺旋拉簧一端扎在上颌第一磨牙上，另一端结扎在上颌中切牙上，并用自凝塑料加固结扎丝与牙连接处。加力值为50g，使磨牙向近中移动。分别在各组时间点将各亚组大鼠处死取材：速眠新深麻，开胸经左心室插管至升主动脉进行灌注固定，先用80～lOOml生理盐水将血管内的血液冲洗干净，再注入含4％多聚甲醛的固定液400ml灌流内固定1．5h，由口腔内切开上颌骨周围软组织，剪断双侧颧突，取出上颌骨，修剪后置于4％多聚甲醛液中固定4天，然后置于由甲醛、甲酸和盐酸组成的脱钙液中脱钙10天。将脱钙的上颌骨去除多余组织，保留磨牙，入30％蔗糖24h 4℃至组织沉底。常规石蜡包埋后，沿近远中方向纵行切片，片厚5um。1．4 HE染色，观察结果：切片进行HE染色：苏木素浸染lOmin，清水冲洗，入盐酸1s，冲洗，稀氨水30s，冲洗，伊红lmin，75％～100％梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。每个标本取包含根尖周的切片二三张，每张切片在×40显微镜下观察压力侧牙周近根尖处组织，计数单个视野内破骨细胞数量(三核以上为纳入标准)。
　　
　　1．5统计学处理：测量所得数据以x±s表示，结果用SPSS 11．0作统计学分析。多组均数问差异性比较用方差分析(F检验)，三组问两两比较用LSD-t检验。P缓释纳米微球组>对照组(PP物质组>对照组(P 体的高分子载药材料。目前对于亲水性药物以PLGA为载体制备载药微球一般用复乳溶剂挥发法。复乳法主要用于亲水性药物，例如蛋白质、疫苗等。P物质易溶于水，溶解度为lmg／m1。所以我们在选择制备方法时，采用了复乳法。所制备的SP―PLGA纳米微球球体均匀度好，冻干粉为白色疏松粉末，再分散性良好。
　　P物质在骨质改建中具有促进骨吸收的功效。Goto等通过大鼠颅骨实验研究发现，极微量的sP就可使颅骨的骨吸收增加。此外，在培养的家兔破骨细胞中加入sP可使破骨细胞内的钙离子浓度增加，从而使破骨细胞的骨吸收活动增加。这种现象可被SP受体的阻断剂所阻断。这些试验表明SP可加速破骨细胞的骨吸收及促进骨的重建。交感神经切除后可引起局部SP释放增加、破骨细胞数量增多及骨吸收表面积扩大。Goto等进一步研究表明，NKl受体广泛分布于破骨细胞的胞膜及胞浆中，而在成骨细胞和其他骨细胞中较少，虽然尚没有直接证据表明SP具有刺激骨吸收的作用，但SP可能通过NKl来调节破骨细胞的骨吸收作用。
　　sP样神经纤维与正畸牙周组织的改建关系密切。Davidovitch等观察了在猫上颌尖牙向远中倾斜移动过程中的P物质反应，发现加力后1hP物质免疫反应就开始增强，尤其在张力区，这种染色增加的现象一直持续到12h，但到24h，其染色密度下降到对照组水平，且一直持续到14天。Norevall等观察了大鼠上颌第一磨牙向颊侧移动过程中的P物质反应，该实验不仅观察了加力阶段而且还包括撤力后牙周组织修复阶段。发现加力后24h或3天，P物质免疫反应明显增强；撤力后14天P物质免疫反应仍然很强；撤力后28天P物质免疫染色强度开始下降，但仍明显高于对照组。有学者推测在正畸牙齿移动过程中，机械刺激导致感觉神经末梢向牙周组织内释放神经介质SP、降钙素基因相关肽等，进一步激活牙周靶细胞(包括成骨细胞、破骨细胞、牙周膜成纤维细胞等)，从而影响这些细胞的生理功能，参与牙周组织的改建。
　　
　　本研究发现：加力后1天，三组问牙周都未发现有破骨细胞；加力后3天，破骨细胞数量表现为P物质组>缓释纳米微球组>对照组；加力后7天，表现为缓释纳米微球组>P物质组>对照组；加力14天后，三组破骨细胞数量都有减少，但缓释纳米微球组数量最多，多于其他两组，P物质组和对照组则无统计学差别，但P物质组绝对值要高于对照组。该结果证明了我们所制备的SP-PLGA NP能缓慢释放活性P物质，同时也表明P物质能促进正畸牙周局部破骨细胞形成。结果也提示SP～PLGA NP可能在加速正畸骨改建中发挥作用，并需要进一步的研究证实。
　　编辑／张惠娟
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