青枯雷尔氏菌噬菌体的研究与应用进展

杨红武，张 胜，符昌武，黄晓艺，黎 萍，钟 杰*

青枯雷尔氏菌噬菌体的研究与应用进展

杨红武1，张 胜2，符昌武3，黄晓艺4，黎 萍5，钟 杰5*

（1. 湖南省烟草公司，湖南 长沙 410004；
2. 湖南省烟草公司湘西自治州公司，湖南 吉首 416000；
3. 湖南省烟草公司张家界市公司，湖南 张家界 427000；
4. 湘西土家族苗族自治州植保种子工作站，湖南 吉首 416000；
5. 湖南农业大学 植物保护学院，湖南 长沙 410125）

青枯雷尔氏菌() 引起的烟草等茄科作物青枯病，是一种世界性重大细菌病害，危害严重且防治困难。利用“噬菌体疗法”防治细菌性病害是近年来生物防治研究的热点。由于近年来抗药性和超级细菌的出现，噬菌体作为病害控制的新方法重新受到重视。综述了噬菌体的发现历程、青枯雷尔氏菌噬菌体发现与分类、挖掘利用，并讨论了噬菌体应用中的问题及发展方向。

青枯雷尔氏菌；
青枯病；
噬菌体；
生物防治

由植物土传细菌性病原菌青枯雷尔氏菌（）引起的青枯病是茄科作物（番茄、马铃薯、辣椒、茄子等）上的一种毁灭性病害，严重影响中国乃至全国各地烟草作物的种植和生产[1-2]。该病菌在烟草和各类茄科作物中都可引起植株死亡，是目前研究最深入的植物致病菌之一。茄科作物青枯病可从植物根部或茎基部侵入植株导管系统，通过增殖和一系列生化活动堵塞或损坏寄主维管束输导组织，导致植株失水枯萎，引起植株发病。该病害起初于1880年被发现于美国北卡罗来纳州格兰维尔[3]，故在当时被广泛称之为格兰维尔凋萎病，在中国俗称为“烟瘟”、“半边疯”。1940年前后，青枯病在美国和印度尼西亚等地为害最为严重[4]。目前该病广泛分布于全世界范围的热带、亚热带和一些温暖地区，在我国南方的广东、湖南、福建、贵州及四川等地发生严重，严重威胁着我国旱地烟草的品质和安全生产[5]。目前国内外学者从化学、生物和农业等方面进行该病的防治研究，其中以培育抗病品种和化学药剂防治为主。但是病原菌生理与致病力分化严重，抗性品种单一，品种抗性容易丧失且在不同种植区域会有差异[6-7]。此外，化学防治对青枯病的防治效果不稳定[8]，且长期大量的化学药剂施用也容易产生抗药性，引起药效下降，药剂用量增加不但增加成本而且污染环境，不利于烟草生产可持续发展。

无论制定何种综合防治措施来控制细菌性病害，采取一个有效和环境友好的控制措施是十分必要的。目前，通过生物抑制剂（内生菌和根际微生物）进行生物防治被认为是降低细菌性病害发病率的替代措施[9-10]。由于生物防治具有高效、无毒、无残留和低成本等特点，是一种具备良好发展潜力和应用前景的防治手段。目前生物防治主要是通过筛选和利用拮抗微生物及无致病力青枯菌菌株。拮抗微生物主要包括拮抗细菌（spp.，spp.和spp.等）、拮抗内生菌、拮抗放线菌、拮抗真菌（木霉、青霉和拮抗菌根真菌）等[8]。这些生物抑制剂以固氮、抗菌化合物、植物生长促进剂和诱导植物免疫抗性等形式为宿主植物带来了广谱效益[11-13]。目前为止，虽然有一系列的生防资源被挖掘，但是大规模用于田间防青枯病的仍然较少，主要是由于防效不稳定、生防微生物的扩散定殖能力弱、易受田间环境影响等因素。近年来，“噬菌体疗法”作为一种新型的、有效的细菌病害防治方式受到越来越多的关注[14]。

环境友好型农业的目标是最大限度地减少农业生产对环境的影响，为不断增长的人口提供安全的食品[15-17]。第二次世界大战之后，抗生素已被纳入畜牧业和用于控制植物病原物[18-22]，但抗生素的滥用会造成耐药性等问题，而噬菌体作为一种环境友好型植物疫苗代替抗生素的使用取得了重要的进展，其被广泛用于治疗人类疾病、畜牧业和抑制植物细菌病原体。噬菌体是一类专性侵染细菌的病毒，在环境中普遍存在。根据噬菌体在侵染宿主过程中是否将自身DNA整合到细菌基因组上的差异，噬菌体可分为烈性噬菌体（lytic phage）和温和噬菌体（temperate phage）两大类。烈性噬菌体也称为毒性噬菌体，可将自身基因组注入到宿主菌体内进行编码和复制，组装成子代噬菌体后将宿主裂解。温和噬菌体侵入宿主细胞后将自身基因组与宿主菌基因组整合，并随细菌分裂传至子代细菌基因组，但不引起细菌裂解死亡[23]。噬菌体最早于1915和1917年被发现，研究发现病原细菌的培养物可以被某种无菌滤液溶解至澄清，将澄清液过滤后加到同样新鲜的病原菌培养液中还能观察到相同的现象，从而发现了噬菌体[24]。随后噬菌体被尝试用来治疗细菌性病害。如在1919年，d’Herelle利用噬菌体治疗细菌性痢疾；
1921年，Brunoghe等[25]利用噬菌体治疗金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌感染；
在1932年噬菌体被用来治疗印度爆发的霍乱[26]。除此之外，噬菌体也被认为是一种植物细菌性病害的防治因子被用于植物细菌性病害的防治[27]。噬菌体最开始被发现能抑制植物细菌性病害，是有研究者从罹患病的白菜中分离获得的滤液可抑制由油菜黄单胞菌引起的白菜茎腐病[28]。后来，Kotila等[29]研究证明噬菌体可抑制欧文氏菌从而防止马铃薯软腐病的发生。在1934年，Massey[30]提出噬菌体是田间棉花细菌性枯萎病发生严重程度的主要限制因子。第一次有记录的田间试验发生在1935年，当时将噬菌体对种子进行预处理，减少了玉米枯萎病的发生。Thomas[31]利用从罹患玉米细菌性枯萎病的植株中分离的噬菌体处理感染病原细菌的玉米种子，病害发生率从18%下降到1.4%。虽然早期研究认为噬菌体用于细菌性病害治疗非常具有潜力，但是噬菌体治疗并不认为是一种控制植物细菌病害的有效手段。究其原因是噬菌体的寄主范围较窄，对施用环境存在局限性，加上抗生素的发现和高效使用使得研究者对噬菌体的研究利用逐渐降低。

由于抗生素的过度使用、基因的水平转移和超级细菌的出现，抗生素的耐药性问题引起了严重的全球健康问题。近年来利用毒性噬菌体控制细菌性病害重新受到了重视。噬菌体可以专一地感染敏感宿主，被当做传统药物疗法的替代品，已被用于水产养殖、食品、人类医学和农业细菌性病害防治等领域，如利用噬菌体疗法在波兰成功治疗了几种人类细菌性疾病[32]。在前苏联，格鲁吉亚等国家已有基于噬菌体治疗的用于不同皮肤和肠道疾病治疗的商品化医疗产品[33]。为了避免形成抗性以及针对不同种类的病原细菌，研究者发明了具有不同受体特异性的噬菌体合剂，称为“鸡尾酒疗法”，可以抑制大范围的细菌感染[34]。由于一系列的实验发现噬菌体具有较好的疗效，噬菌体制剂的开发重新成为了细菌病害防治的热点，关于噬菌体的使用也得到了一些机构的认可。如自2007年，比利时的医学伦理委员会批准可将噬菌体应用于治疗由绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌引起的烧伤感染[35]，美国的食品药品监督管理局也批准了将李斯特菌噬菌体作为备用食物的添加剂来控制单核细胞增生[36]。在丹麦，世界卫生组织（WHO）沙门氏菌噬菌体分型协作中心（健康保护局（HPA））所描述的噬菌体分型已被用于监测肠炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌[37]。

自20世纪90年代以来，噬菌体在植物细菌性病害防治中越来越受到重视和关注。人们发现噬菌体对多种植物细菌均具有防治作用。到目前为止，噬菌体生物防治已经在包括，，，，pv.，，sp，pv.和等植物病原细菌上进行了应用[38]。2005年，噬菌体产品首次在美国环境保护局（environmental protection agency，EPA）注册，该产品用于防治由野油菜黄单胞菌（）和丁香假单胞菌（）引起的番茄和辣椒的细菌斑点病。2011年，EPA拟批准OmniLytics公司的生物农药AgriPhage CMM可用于防治番茄的溃疡病。番茄溃疡病通常由番茄细菌性溃疡病菌（subsp.）亚种引起，可使用该菌的特异性噬菌体作为生物农药来对抗病原菌。2015年，美国德克萨斯农工大学农业生命研究中心的Mayukh Das博士团队，首次筛选出4种针对叶缘焦枯病菌（）的裂解性噬菌体（sano、salvo、prado和paz），并且应用噬菌体鸡尾酒疗法（phage cocktailtherapy）成功防治了葡萄皮尔斯病。2020年，Ramírez等[39]研究发现噬菌体鸡尾酒可作为治疗香蕉枯萎病的生物控制剂，可有效防治香蕉和车前草由引起的“Moko病”。

总之，噬菌体对宿主细菌可以实现精准裂解，靶向治疗，具有特异性强、易分离、扩增速度快、易生产和保存、有自我复制局限性、不易形成抗性等优势[14,24,36,38]，并且噬菌体已经被提议用于一些重要植物病害的生物防治[36]，可见，噬菌体为细菌性病害防治提供了一个有效的途径。

噬菌体在医学领域具有较高的特异性，因为噬菌体不会对人体的健康菌群造成任何伤害[40]。噬菌体有2种类型：（1）宽范围的光谱；
（2）窄范围的光谱。宽光谱范围的噬菌体可以结合宿主细胞表面的多个受体位点（多价噬菌体），而光谱范围狭窄的噬菌体只能结合特定的受体位点（单价噬菌体）。光谱范围狭窄的噬菌体可以通过在噬菌体中存在的受体结合蛋白的点突变转化为大范围的噬菌体。同样，宽光谱范围的噬菌体也可以通过突变受体结合蛋白（RBPs）来限制在一个窄谱内[41]。噬菌体主要由蛋白质衣壳和核酸组成，根据外壳蛋白亚基的折叠组合，噬菌体具有不同的外壳形状，如丝状、球形、蝌蚪形等。核酸类型包括环状或者丝状的单链或者双链 DNA和 RNA，主要分为4类：单链DNA类（ssDNA）、双链DNA类（dsDNA）、单链RNA类（ssRNA）、双链RNA类（dsRNA）。目前已报道的青枯雷尔氏菌噬菌体主要分为双链DNA类型和单链DNA类型。依据形态主要归为肌尾噬菌体科、短尾噬菌体科、长尾噬菌体科，以及丝状噬菌体科等类型。

近年来科学家研究出许多分离噬菌体的方法，它们都依赖于将环境样本作为噬菌体分离的来源。主要原理是噬菌体大多在细菌宿主存在的地方被发现。例如，从渔场[42]中分离出抗感染鱼类的嗜冷黄杆菌的噬菌体，从海洋沉积物中分离出溶解创伤弧菌噬菌体，其中富含活菌[43]。此外，还有仅从受感染的植物插枝[44-46]中分离出了溶解一种感染树木的细菌的噬菌体。从牛粪便样本[47-50]中分离出针对大肠杆菌（）O157：H7和沙门氏菌的噬菌体。青枯雷尔氏菌噬菌体一般从感染青枯病植株的根际土壤中筛选获得[51]。先利用筛子去除土壤中杂物，加入无菌水后振荡培养。离心收集滤液，过0.22 μm微孔滤膜后取不同浓度的土壤溶液滴加到青枯菌选择性培养基中进行涂布。挑取单个噬菌斑与其对应的青枯菌共培养，将共培养液进行离心，再过0.22 μm微孔滤膜，配制含菌平板并滴加不同梯度的噬菌体悬液，进行噬菌斑的观察。通过观察噬菌斑的大小和形态初步筛选噬菌体，通过提取其核酸，进行凝胶电泳后检测其核酸形态，纯化病毒粒子并用透射电镜观察病毒粒子形态。

烈性噬菌体能在敏感宿主菌内快速增殖并使之裂解，也称为毒性噬菌体，因此需要筛选针对特定细菌的毒性噬菌体用以细菌病害防治。目前已有部分噬菌体在引起作物青枯病的青枯雷尔氏菌中被报道[52]。Alvarez等[53-54]报道了利用青枯病菌噬菌体对烟草青枯病的防治效果，当M4S菌株和感染该菌株的噬菌体一起施用时，可使发病率从对照的95.8%下降到14.5%。Fujiwara等[55]发现利用分离到的ΦRSA1、ΦRSB1和ΦRSL1噬菌体单独和组合处理都能快速降低青枯菌的细胞密度。其中，ΦRSL1处理番茄幼苗对细菌的生长和运动有明显抑制作用。此外，该噬菌体具有较好的稳定性，即使在37～50 ℃的高温下，4个月后还能从处理过的植株和土壤中回收到有活性的噬菌体颗粒。Narulita等[56-57]发现短尾噬菌体J2和肌尾噬菌体ΦRSF1具有减少土壤中青枯菌数量减轻病害发生的作用。高苗等[58]分离到的一株青枯菌烈性噬菌体∈RS-1具有潜育周期短、裂解能力强、裂解持续时间长等特点，并具有适应不同温度和酸碱度环境的能力。Addy等[59]研究报道丝状噬菌体φRSM3具有防治青枯雷尔氏菌引起的细菌枯萎病的能力，含有φRSM3的细胞侵染能增强寄主植物病程相关蛋白的表达，预处理的番茄可以免受毒性病原菌的侵染。最近，有研究首次报道从河水中分离到的噬菌体可以在自然条件下通过灌溉水有效防治由青枯雷尔氏菌引起的植物枯萎病。噬菌体可明显降低环境水样中病原细菌的含量以及植株上枯萎病的发生率，并具有在自然条件下比以往所有报道的生防噬菌体更长的持久活性[52]。这说明自然条件下利用噬菌体进行生物防治可作为可持续综合治理方法中的重要环节。蔡刘体等[34]从烤烟田土壤中分离纯化到14个烟草青枯菌烈性噬菌体，其中的ϕPB2、ϕPB8、ϕPB33、ϕPB34和ϕPB35具有较宽的宿主谱，是青枯病防治潜在的生防因子。

除此之外，研究者还从青枯雷尔氏菌中筛选和发现了一些新的噬菌体，对其多样性、基因组和生物学特性进行了研究，为深入了解噬菌体的遗传、进化、寄生机制等提供了重要线索。Addy等[59]筛选到一株具有231 kbp基因组大小的巨型肌尾噬菌体ΦRSL1，并对其基因组结构和编码蛋白进行分析，发现了该噬菌体特异的基因组序列和可能编码的裂解细菌细胞壁的裂解酶。Addy等[60]发现丝状噬菌体φRSS1的侵染能改变其寄主青枯雷尔氏菌的生理状态和细胞行为，使寄主菌致病力增强。噬菌体具有寄主特异性的生物学特性使其可用于检测寄主菌的存在与否。如具有较广裂解谱的噬菌体M_DS1，可以较灵敏地检测烟株和土壤中的青枯雷尔氏菌的存在[61]。

对青枯雷尔氏菌噬菌体进行筛选发现该类菌株中含有丰富的噬菌体资源，通过筛选和利用噬菌体有望开发出可有效防治烟草青枯病的新技术体系。又由于不同的青枯菌具有不同的宿主谱，因此，为了推广和运用青枯菌噬菌体防治方法，需要筛选出对不同菌株专一地、裂解性能强的噬菌体资源。

随着抗生素耐药性威胁的逐渐增加，迫切需要新的抗菌化合物和寻找安全的替代品。噬菌体是一种细菌病毒，在研究、生物技术和治疗方面都具有潜在的用途。噬菌体治疗越来越被认为是一种潜在的替代方案。噬菌体已被用作药物和疫苗的载体，以及许多蛋白质和抗体的显示系统[62]。虽然噬菌体在青枯菌引起其它植物病害的防治中有过一系列的研究报道[39]，但是利用噬菌体防治青枯病目前还没有大规模的推广应用，也没有适合投入生产使用的制剂开发。在细菌宿主中噬菌体耐药性的发展是噬菌体治疗中的一个主要问题。就像细菌可能对抗生素产生耐药性一样，它们也可能通过多种机制对噬菌体产生耐药性。另一方面是噬菌体的应用还存在一些局限性：（1）噬菌体具有宿主特异性，对寄主高度专一。虽然这使噬菌体具有环境安全性，但是同时也使得其治疗谱较窄，只能感染一种或少数几种菌株，有时即使对同一种细菌的不同菌株也没有裂解作用或者作用较弱。（2）噬菌体对环境适应的局限性。有研究表明噬菌体倾向于感染同一块土壤的细菌[31]，所以加大了大规模田间运用噬菌体的难度。细菌的生理小种较多，且变异较大，当细菌受体在与噬菌体识别与结合位点发生变异时可使细菌形成抗性。（3）噬菌体应用易受到田间环境的影响。如土壤温度、pH、直射阳光中的紫外线、土壤湿度等可降低田间土壤中噬菌体群体数量[24]，尤其是紫外线可引起噬菌体急剧减少。（4）噬菌体治疗时的时间和剂量难以掌握，应对不同的植物和耕作方式进一步摸索。

虽然噬菌体应用存在一些局限性，但是它具有比已知抗生素更明显和特殊的优势。针对这些局限性，研究者进行了相应的改进和开发。如由于噬菌体的特异性强，对寄主具有高度专化性，利用噬菌体防治细菌病害时应用与菌株遗传与致病型匹配的噬菌体，并筛选宿主谱宽的噬菌体，同时为了防止细菌对噬菌体产生耐药性，采用的标准做法是使用一种多个噬菌体组合的混合物或称为“鸡尾酒”疗法，其中可能包含噬菌体与宿主范围狭窄、广泛和由宿主范围突变体组成的组合[63-66]，其不但可以提高应用效果还能提高病原菌应对噬菌体突变的能力[67]。为了提高噬菌体在田间的使用持续时间及提高噬菌体浓度，可以将噬菌体制成被包裹的保护性剂型并调节施用时间，如为了避免高日照可在早晚施用[24]。其次，除了传统的噬菌体疗法直接利用噬菌体杀死细菌细胞外，鉴于噬菌体裂解酶的广谱且稳定的裂解活性，可将其开发成杀菌制剂用于细菌性病害的防治。再次，噬菌体与寄主的识别和裂解机制一直是病毒与寄主互作研究的热点。Yamada等[61]探究了噬菌体在菌群中长期保存的机制，发现粘液型细菌对多种裂解性噬菌体具有抗性，这为解决噬菌体如何在细菌群落中的维持提供了一个思路。通过解析噬菌体裂解机制筛选新型抗菌药物靶标将是基于噬菌体技术用于细菌病害治疗的又一个方向[68-69]。此外，噬菌体可作为病害综合防治措施中一个重要的组成部分，噬菌体与其它生防因子一起使用可获得比单一噬菌体或生防材料更好的防治效果[70]。再者，随着噬菌体特异的生物学与分子生物学特性以及噬菌体与宿主菌的相互作用关系的解析，对噬菌体进行改造开发出高效、具有宽寄主谱的噬菌体成为一条可行的途径[71-73]。Tetart等[74]通过重组合成嵌合尾丝噬菌体可改变宿主谱。Mahichi等[75]利用宽宿主谱的噬菌体IP008基因组中g37和g38基因与窄宿主谱T2噬菌体中基因替换，获得重组噬菌体具有与IP008相同的宽宿主谱。

部分噬菌体在作用于病原细菌的同时，还具有重新调整根际土壤菌群结构、增加群落多样性和拮抗微生物丰度的能力[76-78]，而有益微生物的富集又进一步增强了植物抵御病原菌侵染的能力。最近Wang等[79]报道了利用噬菌体组合来防治土传青枯病的研究，并揭示噬菌体一方面通过自身精准靶向地猎杀和致弱病原青枯菌，另一方面通过调控根际微生物群落结构恢复有益微生物丰度来防治青枯病的微生态机制。众所周知，根际是土壤微生物最活跃的区域之一，微生物之间及微生物与植物间存在复杂的互作，它们共同形成了植物的微生态环境。植物根际微生物根际互作的微环境在植物抗性、拮抗微生物利用及病害生物防治效果发挥中起着关键的作用。目前国内外也有一系列关于根际微生物间互作以及微生物与植物互作调控植物抵御病害发生的报道[80-83]。此外，部分根部微生物还能跨界互作帮助植物抗病。如Hassani等[84]报道细菌通过影响真菌病原微生物群落结构来维持微生物界间的平衡以保障植物健康。目前越来越多的研究集中于复杂群落中噬菌体和细菌的共进化，需要更充分了解生物多样性和非生物因素如何影响噬菌体细菌的生态和进化动力学。此外，噬菌体和细菌群落可以对它们的真核宿主产生重大影响。利用噬菌体疗法抵御病害以及通过噬菌体调节微生物群落，需要在包含生物和非生物复杂性的相关模型中研究噬菌体与细菌的相互作用，这会影响噬菌体治疗和共进化的结果。这些研究说明植物微生态对病害防治具有重要的调控作用，在研究噬菌体对靶标病原菌作用的同时，探索其对微生态的调控，开发出以微生态调控为基础的噬菌体生物防治新体系将是未来噬菌体利用的发展方向。

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Research and Application Progress ofPhage

YANG Hongwu1, ZHANG Sheng2, FU Changwu3, HUANG Xiaoyi4, LI Ping5, ZHONG Jie5*

（1. Hunan Tobacco Company, Changsha 410004, China; 2. Xiangxi Branch of Hunan Tobacco Company, Jishou, Hu’nan 416000, China; 3. Zhangjiajie Branch of Hunan Tobacco Company，Zhangjiajie, Hu’nan 427000, China; 4. Plant Protection Seed Workstation of Xiangxi Tujia and Miao Autonomous Prefecture, Jishou, Hu’nan 416000, China; 5. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410125, China）

Bacterial wilt ofcaused byis a major bacterial disease in the world, which is serious and difficult to control. The use of "phage therapy" to control bacterial diseases was a hot spot in biological control research in recent years. Due to the emergence of drug resistance and super-bacteria in recent years, bacteriophages had attracted more and more attention as a new method of disease control. This paper summarized the discovery process of bacteriophages, as well as the discovery, classification, exploitation and utilization ofbacteriophages, and discussed the problems and development direction in the application of bacteriophages.

; bacterial wilt; phage; biological control

S432.4+2

A

2095-3704（2022）03-0283-09

杨红武, 张胜, 符昌武, 等. 青枯雷尔氏菌噬菌体的研究与应用进展[J]. 生物灾害科学, 2022, 45(3): 283-291.

10.3969/j.issn.2095-3704.2022.03.47

2022-08-15

中国烟草总公司湖南省公司科技项目(hn2020kj05)

杨红武（1984—），男，博士生，主要从事烟草生理与烟草植保研究，184621210@qq.com；
*通信作者：钟杰，副教授，博士，wzzhtx@sina.com。