龙胆健肝胶囊在大鼠体内的药物代谢动力学研究*

杨 啸，杨 琳，刘爱霞，于 静，郝玉佩，杨继章，王玲娇△

（1.西安交通大学医学部，陕西 西安 710061；
2.河北医科大学第一医院临床药学部，河北 石家庄 050031；
3.河北省邯郸市第四医院药剂科，河北 邯郸 056200；
4.清华大学附属北京清华长庚医院·清华大学临床医学院临床药物试验中心，北京 100084）

龙胆健肝胶囊是河北医科大学第一医院院内制剂（冀药制字Z20050004），由龙胆、虎杖、茵陈、泽泻、陈皮、山楂等9 味药材组方，有清肝利胆、改善肝功能功效，临床用于治疗和预防脂肪肝。有文献报道，该制剂中的龙胆可清脏腑热、清泻肝胆实火、清利肝经湿热；
虎杖可清热解毒、利湿散瘀；
茵陈可苦泄下降，清热利湿；
泽泻可利水渗湿、化浊调脂［1-4］。龙胆健肝胶囊的有效成分为龙胆苦苷、绿原酸、虎杖苷、金丝桃苷、橙皮苷、大黄酸、大黄素甲醚、川陈皮素。有研究建立了测定制剂中龙胆苦苷、虎杖苷、滨蒿内酯、橙皮苷和大黄素含量的高效液相色谱（HPLC）法［5］，但未完全涉及上述成分的药物代谢动力学（简称药动学）特征［6-7］。为此，本研究中采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC - MS/MS）法研究龙胆健肝胶囊中8 种有效成分在大鼠体内的药动学特征，从而为该药作用机制的研究提供数据支持。现报道如下。

1.1 仪器

TSQ Quantum Access MAX 型超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；
BT125D 型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；
KQ - 400KDB 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
XW-80A 型漩涡混合器（上海医大仪器厂）；
D3024 型台式高速微量离心机（美国Scilogex公司）。

1.2 试药

龙胆健肝胶囊（河北医科大学第一医院制剂室，冀药制字Z20050004，批号为181112）；
龙胆苦苷对照品（批号为110770 - 200409）、大黄酸对照品（批号为0757 - 200206）、橙皮苷对照品（批号为100721 -200512）、大黄素甲醚对照品（批号为100724 -200613），均购自中国食品药品检定研究院；
绿原酸对照品（批号为17081021）、虎杖苷对照品（批号为18112406）、金丝桃苷对照品（批号为18081761）、川陈皮素对照品（批号为18092451），均购自上海士锋生物科技有限公司；
小檗碱对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-16111115）。

1.3 动物

清洁级SD 大鼠6 只，雄性，8 周龄，体质量250～300 g，由河北省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（冀）2018 - 004；
饲养于河北医科大学实验动物房，通风，自由进食饮水，实验动物使用许可证号SYXK（冀）2020 - 002。该动物实验经河北医科大学第一医院实验动物伦理委员会批准（批件号20220201）。

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Polaris C18- A 柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）；
流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～9 min 时10%A →65%A，9～10.5 min 时65%A →100%A，10.5～12 min 时100%A →10%A）；
流速：0.3 mL/min；
柱温：30 ℃；
进样量：10µL。

2.1.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；
多反应监测（MRM）模式；
毛细管电压3 000 V；
鞘气（GS1）压力35 Arb；
辅助气（GS2）压力7 Arb；
毛细管温度300 ℃；
挥发气温度300 ℃。龙胆苦苷、绿原酸、虎杖苷、金丝桃苷、橙皮苷、大黄酸、大黄素甲醚、川陈皮素、小檗碱的母离子/子离子对质荷比（m/z）分别为356.96 →177.12，354.94 →163.13，388.69 →227.04，462.88 →299.96，608.92 →300.94，282.92 →238.98，282.98 →265.27，402.89 →373.08，609.20 →300.00；
碎片能量分别为95，102，122，95，81，96，89，78，111 eV；
撞击能量分别为11，15，23，29，25，18，26，27，40 eV。

2.2 溶液制备与血浆样品预处理［8］

2.2.1 对照品溶液制备

取龙胆苦苷、绿原酸、虎杖苷、金丝桃苷、橙皮苷、大黄酸、大黄素甲醚、川陈皮素对照品各适量，精密称定，置容量瓶中，分别加甲醇溶解并定容，制成单一对照品贮备液。吸取适量，制成各成分质量浓度分别为252.13，32.25，27.09，148.08，72.24，113.92，241.92，10.48 µg/ mL 的混合对照品溶液，- 20 ℃贮存；
使用时，精密吸取适量，用甲醇稀释并定容，制成系列混合对照品溶液。

2.2.2 内标溶液制备

取小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为14.65 µg/ mL 的内标贮备液，再以甲醇稀释至质量浓度为14.65 ng/mL的内标溶液，-20 ℃贮存。

2.2.3 血浆样品预处理

精密吸取血浆样品100µL，置离心管中，加入甲醇300µL，涡旋混合5 min，12 000 r/min 离心5 min，取上清液，即得。

2.3 方法学验证［9］

2.3.1 专属性试验

取大鼠空白血浆100 µL，按2.2.3 项下方法预处理，按2.1项下试验条件进样测定，记录色谱图（图1 A）；
取大鼠空白血浆100 µL，加入混合对照品溶液及内标溶液，按2.2.3 项下方法操作，按2.1 项下试验条件进样测定，记录色谱图（图1 B）；
取大鼠灌胃给予龙胆健肝胶囊30 min 后的血浆样品加入内标溶液，其余步骤均按2.2.3 项下方法操作，按2.1 项下试验条件进样测定，记录色谱图（图1 C）。结果在选定试验条件下，龙胆苦苷、绿原酸、虎杖苷、金丝桃苷、橙皮苷、大黄酸、大黄素甲醚、川陈皮素之间分离良好，且大鼠血浆样品中的内源性物质无干扰，表明方法专属性好。

图1 龙胆健肝胶囊中8个成分及内标的质谱图1.Hesperidin 2.Nobiletin 3.Physcion 4.Berberine（internal standard）5.Polydatin 6.Hyperin 7.Chlorogenic acid 8.Rhein 9.Gentiopicrin A.Blank plasma B.Mixed reference solution+internal standard solution+blank plasma C.Plasma sample after administration+internal standard solutionFig.1 Mass spectrograms of eight components in Longdan Jiangan Capsules and the internal standard

2.3.2 线性关系考察

精密吸取大鼠空白血浆样品100µL，加入2.2.1项下系列混合对照品溶液10 µL，制成系列血浆样品。按2.2.3 项下方法中“加入甲醇300µL”起操作，按2.1项下试验条件进样测定，以各有效成分的质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、各有效成分与内标小檗碱峰面积的比值（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.3.3 精密度和准确度试验［10］

取大鼠空白血浆适量，按2.3.2 项下相关方法操作，分别制得低、中、高质量浓度的混合对照品血浆质量控制（QC）样品，每个质量浓度平行5 个样本，同一日内连续测定5次，连续进样5 d；
另每天进样测定1次，连续测定3 d，求得方法的精密度（QC 样品测定值的RSD）。取上述QC样品，按2.2.3项下方法操作，按2.1项下试验条件进样分析，记录样品仪器响应值（As），及其与内标峰仪器响应值比值（As＇）。另取空白血浆100µL，按2.2.3项下方法操作，加入适量低、中、高质量浓度的混合对照品溶液和内标溶液，涡旋混匀后按2.1项下试验条件进样分析，记录仪器响应信号值（Ar），及其与内标峰面积比值（Ar＇）。提取回收率（内标归一化，%）=As＇/Ar＇×100%。混合对照品血浆样品的日内及日间精密度的RSD均小于12%，表明方法精密度良好。不同质量浓度混合血浆样品的提取回收率为69.94%～93.21%，表明方法准确度较好。

2.3.4 稳定性和基质效应考察

分别考察不同质量浓度混合对照品QC样品（n=5）室温放置、长期冷冻及冻融的稳定性。考察血浆样品在室温放置条件下的稳定性时，将2.3.3项下不同质量浓度的QC 样品在室温放置8 h 后，按2.2.3 项下方法操作，按2.1 项下试验进样分析，计算血浆样品中8 种有效成分含量；
长期冷冻、冻融条件下的稳定性，将不同质量浓度的QC 样品冷冻放置20 d，或从-20 ℃环境中取出于室温待血浆样品解冻后再置- 20 ℃中冰冻，如此冻融反复3 次（间隔24 h），按2.1 项下试验条件进样分析，计算血浆样品中8 种有效成分含量。取空白血浆100 µL，按2.2.3 项下方法操作，取上清液加入相应质量浓度的单一对照品贮备液和内标溶液，得混合血浆样品；
用甲醇代替空白血浆，进行上述操作，按2.1项下试验条件进样分析，计算内标归一化的基质效应。各混合对照品QC 样品3 种条件下的RSD均小于12%，表明相应条件下样品均稳定。各混合血浆样品的内标归一化的基质效应为89.31%～109.29%，表明该方法不存在明显的基质效应。

2.4 药动学特征［11］

取SD 大鼠6 只，分别灌胃给予龙胆健肝胶囊0.80 g/kg（参考8 倍临床等效剂量），分别于给药前及给药后0.08，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，12，24，48 h 眼内眦取血0.5 mL，置经肝素钠抗凝处理过的离心管中，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆，置-20 ℃贮存。测定血药浓度，采用DAS 2.0 药动学软件分析数据，计算药动学参数。结果各有效成分药动学参数符合二室模型，详见表2（t1/2为半衰期，Tmax为达峰时间，Cmax为峰浓度，AUC为血药浓度- 时间曲线下面积）。

表2 龙胆健肝胶囊中8个成分的主要药动学参数（±s，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of eight components in Longdan Jiangan Capsules（±s，n=6）

表2 龙胆健肝胶囊中8个成分的主要药动学参数（±s，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of eight components in Longdan Jiangan Capsules（±s，n=6）

待测成分龙胆苦苷绿原酸虎杖苷金丝桃苷橙皮苷大黄酸大黄酸甲醚川陈皮素t1/2（h）22.64±17.13 159.12±58.54 187.94±86.82 858.64±1 081.14 2 148.83±4 027.38 162.10±218.47 12.50±2.29 1 053.73±1 244.01 Tmax（h）1.50±0.00 0.50±0.00 0.75±0.00 0.50±0.00 0.08±0.00 0.08±0.00 6.00±0.00 0.25±0.00 Cmax（ng/mL）587.38±39.53 26.57±4.00 34.83±2.64 51.29±4.97 58.96±2.22 114.26±7.71 825.19±86.03 1.83±0.03 AUC0-t［ng/（mL·h）］4 042.37±140.73 340.37±6.86 908.15±37.52 908.16±5.64 1 356.61±37.68 1 340.83±62.95 15 304.41±1 798.75 64.32±0.53 AUC0-∞［ng/（mL·h）］5 036.77±1 327.70 1 758.56±548.25 5 765.98±2 312.19 23 902.22±28 980.69 91 124.87±171 255.72 6 621.93±7 660.00 16 540.14±1 798.01 2 050.67±2 373.89

根据前期实验结果及文献报道，本研究中选择了制剂中含量较高的8种有效成分作为待测成分，初步研究各成分在大鼠体内的药动学特征。血浆样品分别采用乙腈沉淀法、乙酸乙酯萃取法、甲醇沉淀法和正丁醇萃取法进行前处理，发现甲醇沉淀法提取率相对较高，而其余3 法的提取率均较低，且内源性物质干扰少，因此采用甲醇沉淀法沉淀蛋白。流动相考察中，选择甲醇-水作为流动相时，所得峰形均较差，且拖尾严重，而加入不同比例的甲酸后拖尾和峰形均有所改善，经多次试验后，最终选择了0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液作为流动相。

中药复方制剂的成分复杂，各成分含量较低。龙胆健肝胶囊有效成分含量低，灌胃给药后大鼠血浆中的药物浓度更低，因此对其有效成分在大鼠体内的药动学研究十分困难。实验中发现，给药剂量较低时，川陈皮素难以在血中检测到，为研究其体内药动学过程，多次调整剂量后，最终以临床等效剂量的8倍作为大鼠给药剂量。结果显示，大鼠灌胃给药后，龙胆苦苷、绿原酸、虎杖苷、金丝桃苷、橙皮苷、大黄酸和川陈皮素的Tmax在0.08～1.50 h，说明均可被快速吸收入血。灌胃6 h 后8 种成分血药浓度均降低，说明制剂的有效成分在大鼠体内均可被快速代谢。龙胆苦苷和大黄素甲醚在大鼠血浆中的浓度较高。本研究中龙胆苦苷、大黄酸、大黄素甲醚出现明显的第2吸收峰，可能与其存在肝肠循环有关，文献［5，12 - 13］报道其在体内未出现双峰现象，这可能与其他成分的相互作用有关。文献［13］报道金丝桃苷出现明显的第2吸收峰，可能与其存在肝肠循环有关，但本研究中金丝桃苷未出现双峰现象，可能与复方中其他成分的相互作用有关。绿原酸、虎杖苷、橙皮苷、川陈皮素的AUC则与文献［13-18］一致。

综上所述，本研究中建立的UPLC - MS/ MS 法快速简便、稳定可靠，适用于龙胆健肝胶囊在大鼠体内的药动学研究，为进一步研究制剂有效成分的药理作用机制提供了参考。