梅迪-维斯纳病毒实时荧光RPA检测方法的建立

刘 然，张 琳，陈思旭，史晓娜，刘淑英

(内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

梅迪-维斯纳病（Maedi-visna disease，MVD）是由逆转录病毒科慢病毒属的梅迪-维斯纳病毒（Maedi-visna virus，MVV）所引起的绵羊的一种慢性、进行性、接触性疾病[1]。该病可引起患病动物消瘦、呼吸困难、麻痹、跛行和多器官炎症反应[2]，组织病理学可见淋巴滤泡增生和肺泡间质增宽[3]。MVD在世界许多养羊国家普遍存在[4]，且MVV可在宿主体内造成持续感染[5]。MVD给国内外养殖户造成了一定经济损失，目前尚无有效疫苗和药物对其进行防治[6-7]。因此需要建立早期、快速、有效的诊断方法，及早发现并进行防控。

诊断MVD的常用方法有病理剖检和实验室诊断。病理剖检存在一定局限性，无法在生产实践中广泛使用[8]。实验室诊断包括血清学检测和分子生物学检测。血清学检测常用酶联免疫吸附试验（ELISA），但MVD潜伏期长，血清转化需要数周甚至数月[9-10]，这期间感染动物持续排毒，作为传染源长期影响羊群健康[11]；
分子生物学检测方法主要是PCR和荧光定量PCR，相较于ELISA，其可以直接检测动物体内的病毒核酸[12]，虽然能够实现早期诊断，但程序繁琐、耗时较长等缺点也限制了其在基层实验室的使用。因此建立一种简便、快速的MVV检测方法具有重要实践意义。

随着诊断技术的不断更新，临床诊断更加追求准确高效。Piepenburg等[13]于2006年提出了一项新型恒温扩增技术——重组酶聚合酶恒温扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）。通过重组酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白在37～42 ℃条件下扩增，再以侧向流纸层析或实时荧光等方法展现结果[14]。而荧光RPA结合了荧光定量PCR和环介导等温扩增反应（LAMP）的优点，仅需一条探针和引物对，在恒温条件下短时间内即可获得诊断结果[15]。因此本研究选择基于MVVgag基因保守序列设计特异性引物和探针，以MVV病肺组织DNA为模板，建立MVV实时荧光RPA检测方法，以期为MVD的诊断提供技术手段。

1.1 病料组织及相关病原

自然感染MVV的肺组织，由本实验室保存。其他病原：小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）、羊败血性链球菌（ovineStreptococcosis septicemia，OSS），由本实验室保存；
牛肠道病毒（bovine entero virus，BEV）、传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type3，BPIV3）、肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO），由内蒙古农业大学郝永清教授实验室提供。

1.2 主要试剂与仪器

动物组织、细胞与昆虫总RNA快速提取试剂盒、血液/组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒和琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒，购自北京金佰特生物技术有限公司；
反转录试剂盒，购自Vazyme；
TwistAmp exo kit试剂盒，购自英国TwistDx Inc公司；
核酸恒温扩增荧光检测仪AGS8800，购自杭州安誉科技有限公司。

1.3 引物、探针设计与合成

参照GenBank（登录号MW248464）中MVVgag基因序列，运用Primer Premier 5.0软件，按照RPA引物探针设计原则，设计7对引物和1条探针，并合成gag-PCR[16]和LTR-PCR[17]试验所需引物。经NCBI数据库BLAST验证引物特异性后，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。具体见表1～2。

表1 PCR引物信息

1.4 荧光RPA方法建立

1.4.1 阳性模板鉴定 提取MVV感染肺组织的DNA，通过LTR-PCR扩增目的片段并进行鉴定，将鉴定为MVV阳性的组织DNA作为模板备用。

表2 RPA引物和探针信息

1.4.2 核酸提取及其他病原模板制备 提取PPRV、BEV和BPIV3 RNA，使用酶标仪检测质量浓度与纯度，分别反转录为cDNA备用；
提取IBRV、OSS和MO DNA备用。具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 荧光RPA反应体系和反应条件确定 使用TwistAmp exo Kit进行荧光RPA扩增，反应总体系为50 μL。将47.5 μL预混液（表3）转移至冻干酶粉反应管中，加入2.5 μL（0.28 mmol/L）MgAc溶液启动反应。经混匀、瞬离后放入恒温核酸扩增仪中，4 min后取出混匀，再继续反应16 min。在整个过程中用仪器收集HEX荧光信号，根据荧光扩增曲线进行结果判定。

表3 RPA预混液体系

1.4.4 最佳引物对及反应温度筛选 将7组引物对进行荧光RPA检测，结合荧光扩增曲线，筛选出最佳引物对。在反应温度为37～42 ℃条件下，使用最佳引物对进行荧光RPA检测，筛选出最佳反应温度。

1.4.5 特异性试验 在最佳反应条件和体系下，将上述提取的各病原核酸以及空白对照作为模板，进行荧光RPA检测，以验证该方法的特异性。

1.4.6 灵敏度试验 以上述提取的MVV病肺DNA为模板，10倍倍比稀释后进行荧光RPA检测（包含空白对照），确定灵敏度。同时与PCR检测结果进行比较。

1.4.7 重复性试验 选取两个不同质量浓度的病肺DNA为模板，进行荧光RPA检测，并重复3次。通过荧光曲线达到阈值的时间计算变异系数，以验证建立的MVV荧光RPA检测方法的稳定性。

1.4.8 样品复核检测 对本实验室保存的MVD阴性和阳性临床羊肺样品，分别进行荧光RPA检测和PCR检测，并对比二者检测结果。

2.1 MVV阳性模板鉴定

对本实验室保存的自然感染MVV的羊肺组织进行LTR-PCR鉴定，结果PCR扩增产物约300 bp，条带单一，大小与目的片段一致（图1）。

图1 MVV阳性模板鉴定结果

2.2 最佳引物对筛选

将探针分别与7组引物对进行荧光RPA检测，结果7组引物对均能在约5 min时产生荧光信号，其中F3/R3扩增速度最快，且荧光峰值最高（图2）。因此，选用F3/R3引物对进行后续试验。

图2 RPA最佳引物对筛选结果

2.3 最佳反应温度筛选

使用F3/R3引物对，进行荧光RPA检测以筛选反应温度。结果（图3）显示，37～42 ℃均出现较强的荧光信号。将不同温度下的荧光吸收值和Ct值结合绘制折线图（图4），发现39 ℃条件下能够在较低Ct值获得最高荧光吸收值。结果表明此温度下扩增速率和效率均达到最佳，故确定该方法的最佳反应温度为39 ℃。

图3 最佳反应温度筛选结果

图4 最佳反应温度筛选折线图

2.4 特异性试验

结果（图5）显示，除MVV外，其他病原核酸和空白对照均未出现扩增曲线。结果表明该方法能特异性检测到MVV，而与PPRV、OSS、BEV、IBRV、BPIV3、MO等无交叉反应。

图5 RPA特异性检测结果

2.5 灵敏度试验

以10倍倍比稀释的病肺DNA（质量浓度102～10-3pg/μL）为模板，进行荧光RPA检测。结果（图6）显示，所建立的方法检测浓度下限为10-1pg/μL，即待测样品中存在10-1pg/μL以上的病毒就能被检测到。同时将模板稀释后（质量浓度105～10-1pg/μL），进行gag-PCR试验。结果（图7）显示，PCR灵敏度为103pg/μL。结果说明RPA检测灵敏度是PCR的约104倍，且检测时间显著缩短。

图6 RPA灵敏度检测结果

图7 PCR灵敏度检测结果

2.6 重复性试验

为评估所建立方法的稳定性和重复性，选取质量浓度为105pg/μL和102pg/μL的自然感染MVV的病肺组织DNA，进行荧光RPA重复性试验。结果（图8）显示，该方法对于相同质量浓度模板的检测结果判定一致，均可观察到扩增曲线，两种质量浓度样品DNA检测变异系数分别为7.28%和4.21%，均小于10%。结果表明所建立的MVV RPA荧光检测方法稳定性良好。

图8 RPA重复性检测结果

2.7 样品复核检测

使用MVV荧光RPA和LTR-PCR方法，对实验室已通过病理组织学和常规PCR检测的MVV阴性和阳性肺组织样品（共8份）进行复核。结果显示：荧光RPA检测1、2和7号未出现扩增曲线，其余5份均出现明显扩增曲线（图9-A），该结果与LTR-PCR检测结果一致（图9-B）。结果表明本研究建立的MVV荧光RPA方法可有效检出MVV。

图9 样品复核检测结果

MVD出现临床症状时即为晚期[18]。为对其进行早期防控，减少养殖户经济损失，本实验室王多智等[19]和李慧萍等[20]分别建立了检测MVV的巢式PCR和荧光定量PCR方法。二者能够有效检测病羊体内MVV，但耗时相对较长，操作复杂，无法实现快速检测。因此建立早期快速的MVD诊断方法，对及时淘汰患羊进而净化羊群显得尤为重要。

RPA技术是重组酶与引物结合形成复合物，在模板上寻找同源序列后，发生链交换并启动DNA合成，对目的基因进行指数扩增。RPA相较于PCR操作简单，不需要PCR仪等热循环仪器设备[21]。荧光RPA技术结合探针，在常温条件下使用恒温扩增仪15～30 min即完成实时检测，具有节省时间成本、高效便捷的优点。同时，反应体系所需的酶均以冻干粉形式保存，方便运输，且仪器体积小易携带，适用于现场检测和基层生产实践[22-23]。强焜等[24]建立了荧光RPA检测田鼠巴贝虫方法，对巴贝虫病诊断及血液安全风险监测具有参考意义；
郭正洋等[25]建立了单核细胞增生李斯特菌荧光RPA检测技术，为现场检测提供快速可靠的方法；
张静远等[26]建立了非洲猪瘟荧光RPA检测方法，给基层防控提供了技术支撑。以上检测方法的建立说明荧光RPA技术已被成熟应用于各类病原体检测，可对寄生虫以及脏器和血液中的细菌及病毒进行检测。这为建立MVV荧光RPA方法，实现MVD早期防控提供了可靠依据。

靶序列选择是荧光RPA反应实现最优效果的主要决定因素。对本研究团队赵玲等[27]登入GenBank中的MVV全基因组序列（登录号MW248464）分析发现，gag区域的同源性为82.8%～86.8%，序列相对保守，因此选择gag作为靶基因设计多对引物/探针并进行筛选。荧光RPA技术的关键在于引物和探针，其引物序列较常规PCR引物序列长，引物过短则影响重组效率，降低反应的灵敏度和扩增速率。通过对多组引物配合探针的效果进行筛选，发现F3/R3引物对能够最快达到荧光峰值，可用于后续试验。除上述内在决定因素外，温度是影响RPA反应速率的重要外在因素。因此在筛选最佳引物对后，设置37～42 ℃温度梯度进行荧光RPA检测，发现39 ℃时能够在短时间内达到荧光峰值，扩增效果最佳。本试验结合扩增荧光峰值和起峰时间，选取F3/R3为最佳引物对，39 ℃为最佳反应温度。值得注意的是，反应期间取出反应管混匀后放回仪器，目的是充分混匀各组分，提高反应速率和灵敏度[28]。

本研究以MVVgag基因保守序列为靶基因，按照TwistDX Inc公司引物和探针设计原则，设计并筛选出探针和最佳引物对，建立了在39 ℃、20 min即可检出MVV的荧光RPA方法。性能评估结果表明，所建立的方法重复性好，变异系数均小于10%；
特异性强，与其他常见继发呼吸系统疾病的病原均无交叉反应；
灵敏度高，最低可检测MVV核酸质量浓度为10-1pg/μL；
可信度高，与PCR检测结果一致。综上所述，本研究建立的MVV荧光RPA检测方法，特异性强，灵敏度高，反应快速，操作方法简单，是快速诊断MVD的有效手段，对基础设施相对较差的羊场开展MVD快速筛查具有重要意义。