酰基甘油激酶通过影响PTEN/PI3K/Akt/Gsk3β信号通路调控血小板活化

张鹏 毕昌龙 魏萌 姜哲轶 张田田 张俊峰

以冠状动脉血栓与脑卒中为主的动脉血栓性疾病的患病率、致死率和致残率高，严重威胁人类健康[1]。在动脉血栓的形成过程中，血小板活化处于中心环节[2-3]。临床应用的抗血小板药均通过特异性阻断血小板活化过程发挥作用，因此，研究血小板活化调控机制对新型抗血小板药物的研发具有重要意义。

酰基甘油激酶（AGK）最早作为线粒体内膜蛋白被发现，具有重要的脂质激酶活性，能够催化酰基甘油磷酸化，生成磷脂酸[4]。AGK 还有协助物质运输的功能，且该功能不依赖其激酶活性[5]。近年来，AGK 被证实在多种实体肿瘤中高表达，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[6-8]。Jiang等[9]发现AGK 可以调控巨核细胞的分化和血小板的生成。本研究探讨AGK 在血小板活化中的作用及可能的调控机制。

1.1 实验动物

雄性C57BL/6J 野生型小鼠（WT）12 只，8 周龄，由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房进行SPF 级标准饲养。雄性Agk G126E 点突变小鼠（PM）12 只，8 周龄，该小鼠模型AGK 126位点从甘氨酸对应的密码子GGC 突变为谷氨酸对应的密码子GAA，使AGK 的丧失脂质激酶功能。模型构建后采用Sanger 测序确定PM 小鼠点突变的基因型，Western blot 法检测AGK 蛋白表达水平。该小鼠由上海交通大学基础医学院刘俊岭教授实验室赠予。

1.2 实验试剂与仪器

凝血酶（α-Thrombin）、二磷酸腺苷（ADP）、血栓素A2 类似物（U46619）购自美国Sigma-Alrich 公司。三磷酸腺苷（ATP）释放的荧光检测剂CHRONO-LUME 购自美国CHRONO-LOG公司。荧光素偶联纤维蛋白原（Fg）购自美国Thermo Fisher 公司。抗磷酸化张力蛋白同源性磷酸酶（PTEN）抗体、抗磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗体、抗磷酸化蛋白激酶B（Akt-Thr308）抗体、抗磷酸化糖原合成激酶3β（Gsk3β-Ser9）抗体、抗β-actin 抗体、辣根过氧化物酶标记二抗均购自美国Cell Signaling Technology 公司。抗AGK 抗体购自美国Santa 公司。动物血球分析仪购自美国HEMAVET 公司，血小板聚集仪购自美国CHRONO-LOG 公司，流式细胞仪购自美国Beckman 公司。

1.3 制备洗涤血小板

WT 和PM 小鼠麻醉后经腹主动脉取血，动物血球分析仪检测每只小鼠的血小板数量，血液经2 次离心获得血小板沉淀，再加入血小板平衡盐溶液将血小板吹匀，计数至3×108/mL，于37 ℃水浴静息待用。

1.4 血小板聚集实验

血小板聚集仪预热至37℃，取300 μL WT 或PM 小鼠洗涤血小板加至血小板聚集管中，将聚集管放入血小板聚集仪的孔道并建立基线。待基准线平稳后，分别向血小板聚集管中加入不同浓度的激动剂，包括α-Thrombin、U46619、ADP，记录5 min 内的血小板聚集曲线，每组进行4 次独立重复实验。

1.5 血小板ATP释放实验

当WT 或PM 小鼠的血小板由α-Thrombin、U46619 或ADP 刺激产生的聚集曲线于5 min 到达平台期时，加入10 μL ATP 荧光检测剂CHRONOLUME，记录释放曲线3 min，每组进行4 次独立重复实验。

1.6 血小板Fg结合实验

分别设置静息组（不加α-Thrombin 刺激）WT 或PM 小鼠血小板、活化组（加α-Thrombin至终浓度0.08 U/mL）WT 或PM 小鼠血小板。用血小板平衡盐溶液将WT 和PM 小鼠的洗涤血小板稀释成6×107/mL，吸取100 μL 稀释后的血小板，加入荧光素偶联的Fg 2 μL，轻轻混匀后，37 ℃避光孵育30 min。加入4%甲醛固定液400 μL，避光混匀，用流式细胞仪分析。每组进行8 次独立重复实验。

1.7 血小板活化通路蛋白磷酸化水平检测

收集静息组（不加α-Thrombin、U46619或ADP 刺激，未进行聚集实验）及活化组（经α-Thrombin、U46619 或ADP 刺激，完成聚集实验）的血小板样品，SDS 缓冲液提取蛋白，10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转膜，5%牛奶封闭1 h。抗p-PTEN、p-PI3K、p-Akt-Thr308、p-Gsk3β-Ser9 和β-actin 抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后室温孵育二抗1 h。利用化学发光底物显色，ImageJ 软件进行灰度分析。目的蛋白磷酸化水平＝磷酸化蛋白灰度值/总蛋白灰度值，每组样品的检测结果重复3 次。

1.8 统计学分析

使用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，数据呈正态分布且方差齐，组间比较采用t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2.1 PM小鼠构建

Sanger 测序基因型鉴定结果表明，PM 小鼠点突变构建成功；
Western blot 法检测结果显示Agk G126E 点突变不影响AGK 蛋白的表达，见图1。WT 和PM 小鼠的血小板计数无统计学差异[（0.94±0.03）×1012/L 对（0.90±0.12）×1012/L，P＞0.05]，Agk G126E 点突变未对血小板数量产生影响。

图1 PM小鼠鉴定

2.2 3种刺激剂作用下WT和PM小鼠血小板的聚集程度

血小板聚集的检测结果表明，PM 小鼠的血小板在α-Thrombin（0.08 U/mL）、ADP（25 μmol/L）和U46619（1.5 μmol/L）刺激下的聚集程度均明显低于WT 小鼠（P均＜0.01），见图2、表1。

图2 3种刺激剂作用下血小板的聚集曲线

2.3 3种刺激剂作用下WT和PM小鼠血小板的ATP释放水平

血小板ATP 释放的检测结果表明，PM小鼠的血小板在α-Thrombin（0.08 U/mL）、ADP（25 μmol/L）和U46619（1.5 μmol/L）刺激下的ATP 释放水平均明显低于WT 小鼠（P均＜0.01），见图3、表1。

图3 3种刺激剂作用下血小板ATP的释放曲线

表1 活化血小板聚集和ATP释放水平比较

2.4 α-Thrombin刺激下WT和PM小鼠血小板Fg结合能力

流式结果表明，静息组WT 和PM 小鼠血小板Fg 结合的流式曲线高峰位置相近，平均荧光强度值相近。在α-Thrombin（0.08 U/mL）刺激后，与PM 小鼠相比，WT 小鼠的血小板Fg 结合的流式曲线高峰明显右移，平均荧光强度值明显降低（6 010.5±153.8 对4 336.0±135.6，P＜0.001），提示PM 小鼠血小板Fg 结合能力明显减弱。见图4。

图4 血小板Fg结合的流式曲线

2.5 3种刺激剂作用下WT和PM小鼠血小板活化过程的通路蛋白磷酸化水平

Western blot 检测结果表明，与活化组血小板相比，静息组WT 和PM 小鼠血小板中的相应信号分子的磷酸化水平较低。见图5。在同等刺激剂α-Thrombin（0.08 U/mL）、ADP（25 mmol/L）和U46619（1.5 μmol/L）刺激下，与WT 小鼠相比，PM 小鼠血小板活化过程中PTEN、PI3K、Akt-Thr308、Gsk3β-Ser9 的磷酸化水平均有所降低（P均＜0.01），见图5、表2。

图5 血小板活化过程的通路蛋白磷酸化水平检测

表2 血小板活化过程的各组蛋白磷酸化水平比较

聚集是血小板活化的重要表现形式之一，也是止血和动脉血栓的基础。血小板的致密颗粒中含有大量的ATP，当血小板活化时，ATP 会被释放至胞外[2]。Fg 是血小板黏附受体GP Ⅱb/Ⅲa 的天然配体，在血小板静息时，二者的结合作用很弱；
当血小板活化时，GP Ⅱb/Ⅲa 胞外构象改变，对Fg 的亲和力显著增强[10]。因此，血小板聚集程度、ATP 释放水平及Fg 结合能力是体外研究中评估血小板活化的经典指标。将 AGK 的第126 位氨基酸G（甘氨酸）突变成 E（谷氨酸），可以剥夺其激酶活性[4]，但对AGK 蛋白的表达没有影响[5,11]。本研究发现，在同种刺激剂作用后，PM 小鼠的血小板聚集程度、ATP 释放水平和Fg 结合能力均明显降低，提示AGK 激酶活性缺失会导致血小板活化水平明显受损。

Wang等[8]研究表明AGK可以激活PI3K/AKT 信号通路，调节乳腺癌的细胞周期。Zhu 等[6]研究发现，AGK可以激活PI3K/Akt/GSK3β 信号通路，促进肾癌的进展、转移。这些研究提示AGK 过表达水平与关键信号分子的磷酸化水平呈正相关。Hu 等[12]发现AGK 可以磷酸化PTEN，使PTEN 失活，从而活化PI3K/AKT 信号通路，增强CD8+T 细胞的糖酵解能力。

PI3K 是高度保守的酶家族，可以在多种血小板受体下游被激活[13-14]，其转导的信号可以促进血小板黏附和聚集，通过活化GP Ⅱb/Ⅲa 和增强Ca2+释放促进血栓形成[15]。Akt 是PI3K 激活的主要下游酶[16]，PI3K能促进Akt的308位苏氨酸的磷酸化，在G 蛋白偶联受体（GPCR）介导的血小板活化中起关键作用[17]。Gsk3β 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以阻断GP Ⅱb/Ⅲa 介导的“外-内”信号对血小板的聚集、铺展、栓块收缩和血栓稳定的作用，进而起负向调节作用，而Akt 可以磷酸化Gsk3β 第9 位丝氨酸，抑制其激酶活性[18]。PTEN 是血小板PI3K/Akt 信号的负向调节因子[19-20]，而PTEN 的磷酸化会使其活性丧失。本研究通过3 种GPCR 激动剂刺激血小板活化，发现PM 小鼠血小板活化信号通路中PTEN、PI3K、Akt-Thr308 和Gsk3β-Ser9的磷酸化水平均有所降低，提示AGK 激酶活性的丧失影响了信号分子的磷酸化水平。

综上所述，本研究结果显示AGK 可能通过影响PTEN/PI3K/Akt/Gsk3β 信号通路，参与调控血小板的活化。血小板活化的信号转导过程错综复杂，AGK 是否存在其他调控机制，能否成为新的抗血小板药物研发靶点，尚需进一步深入研究。