自体血小板富集血浆联合粒细胞集落刺激因子宫腔灌注对反复着床失败患者子宫内膜容受性及临床结局的影响Δ

马 宁，周 知，周 璟，胡嘉嘉，赵立强，陈 姣，卢伟英(海南省妇女儿童医学中心生殖医学中心，海口570206)

反复着床失败(repeated implantation failure，RIF)是不孕症治疗领域的一大难题，更已成为阻碍体外受精(invitrofertilization，IVF)妊娠率进一步提高的瓶颈，RIF指优质胚胎在几个新鲜和(或)冷冻胚胎移植周期后仍未能植入子宫内膜而获得临床妊娠，这不仅给患者带来了一定的心理负面情绪，更加重了其经济负担，进而影响再次移植结局[1]。RIF的发生可能与胚胎缺陷、内分泌、血栓前状态、遗传因素和免疫状态等相关，同时子宫内膜容受性(endometrial receptivity，ER)下降也是影响胚胎着床的主要因素之一，因此，如何改善胚胎种植环境，即提高ER一直是临床攻克RIF的关键靶点[2]。近年来，宫腔灌注治疗备受关注，其灌注方式主要包括自体细胞及药物。血小板富集血浆(platelet-rich plasma，PRP)是从患者新鲜全血中提取的血浆血小板浓缩物，含有多种细胞因子及一大类生长因子，PRP在创面愈合、口腔种植骨再生等方面均有应用，近年来也有国内外研究结果表明PRP可作为治疗RIF及薄型子宫内膜的创新型方式[3-4]。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是一种糖蛋白，能够刺激中性粒细胞分化及增殖，并通过一定机制改善ER[5]。有研究结果表明，宫腔灌注G-CSF能够改善子宫内膜发育状态和血流灌注，从而提高临床妊娠率[6]。基于此，本研究采用回顾性分析，探究PRP联合G-CSF宫腔灌注对RIF患者ER及临床结局的影响，以期为临床治疗RIF提供参考，报告如下。

1.1 资料来源

选择2020年1月至2022年7月于我院就诊的RIF患者76例，按照冻融胚胎移植前是否进行宫腔灌注，分为PRP+G-CSF灌注组(n=38)和对照组(未灌注，n=38)。RIF诊断标准：年龄<40岁，已接受≥3个新鲜胚胎移植周期或者冻融胚胎移植周期，且累计移植≥4枚优质胚胎而未能临床妊娠者[7]。纳入标准：基础卵泡刺激素(FSH)<10 U/L；
无输卵管积水或已结扎；
内分泌检查正常；
自身免疫性抗体如抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗甲状腺抗体及抗β2-糖蛋白1抗体阴性。排除标准：存在盆腔肿瘤患者；
有妊娠禁忌证或患有对妊娠有明确影响的疾病者；
子宫解剖结构异常(单角子宫、双角子宫、双子宫和纵隔子宫)者；
存在重度子宫内膜异位症、黏膜下子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫内膜息肉及宫腔粘连等患者；
夫妻双方存在染色体异常者；
存在精神障碍或无法配合治疗者；
存在血液系统疾病者，如遗传性易栓症等；
对本研究药物过敏者。

1.2 方法

1.2.1 冻融胚胎移植的内膜准备方案：(1)降调节激素替代周期。月经期第2—3日皮下注射注射用醋酸亮丙瑞林微球(规格：3.75 mg)3.75 mg，28～30 d后口服戊酸雌二醇片(规格：1 mg)6 mg/d。当内膜厚度≥7 mm时，口服黄体酮胶囊(规格：50 mg)300 mg/d及阴道用黄体酮软胶囊(规格：0.1 g)600 mg/d转化内膜，内膜转化第4日移植1～2枚卵裂胚，或第6日移植1～2枚囊胚。(2)激素替代周期。月经期第2—3日直接口服戊酸雌二醇片(规格同上)6 mg/d。当内膜厚度≥7 mm时，口服黄体酮胶囊(规格同上)300 mg/d及阴道用黄体酮软胶囊(规格同上)600 mg/d转化内膜，内膜转化第4日移植1～2枚卵裂胚，或第6日移植1～2枚囊胚。(3)促排卵周期。月经期第2—3日口服来曲唑片(规格：2.5 mg)2.5～5 mg/d，共5 d，定期监测卵泡发育，待排卵后口服黄体酮胶囊(规格同上)300 mg/d及阴道用黄体酮软胶囊(规格同上)400 mg/d黄体支持，在排卵后的第4日移植1～2枚卵裂胚，或第6日移植1～2枚囊胚。

1.2.2 PRP的标准化制备：采用患者自体外周血，以两步离心法制成，使用装有柠檬酸钠抗凝溶液1.5 mL的注射器抽取患者静脉血20 mL，1 200 r/min离心(离心半径15 cm)12 min后，吸取上层富含血小板的上清液，再次以2 500 r/min离心(离心半径15 cm)7 min，吸弃离心管内上清液，得到剩余约1 mL液体，吹打混匀沉淀即为PRP，尽快用于宫腔灌注。

1.2.3 宫腔灌注：患者充盈膀胱，取膀胱截石位，以安尔碘Ⅲ型皮肤消毒剂消毒外阴，使用窥器暴露宫颈，用安尔碘Ⅲ型皮肤消毒剂棉球擦洗阴道及宫颈，用干棉球将阴道内多余液体擦干；
将一次性使用无菌胚胎移植管接上2 mL注射器，抽取处理后的PRP液及重组人粒细胞刺激因子注射液[规格：9.0×106IU(150 μg)/0.9 mL]0.9 mL混匀，在腹部超声的引导下将一次性使用无菌胚胎移植管经宫颈缓慢送入宫腔，调整管尖距宫底约1 cm处将混合液无阻力下全部缓慢注入宫腔，停留30 s后轻轻取出一次性使用无菌胚胎移植管；
必要时可使用宫颈钳牵拉宫颈，以便于一次性使用无菌胚胎移植管顺利进入宫腔；
术后患者于手术床上臀高位静躺5 min后于观察室观察30 min。对照组患者则不进行宫腔灌注处理。

1.3 观察指标

(1)两组患者胚胎种植率比较：胚胎种植率=B超发现宫内孕囊数/移植胚胎总数×100%。(2)两组患者妊娠结局比较：记录临床妊娠率、生化妊娠率、早期流产率、异位妊娠率以及PRP+G-CSF组宫腔灌注不良事件发生情况。于胚胎移植4～6周采用B超检查见宫内妊娠囊存在卵黄囊、胚芽及原始心管搏动为临床妊娠。卵裂胚移植后14 d、囊胚移植后12 d检测β-HCG≥25 IU/L为化学妊娠。妊娠12周前发生胚胎停育或自然流产定义为早期流产。(3)两组患者子宫内膜及血流动力学指标比较：于胚胎移植日行阴道超声检查，记录子宫动脉搏动指数(PI)、阻力指数(RI)，并参照Gonen标准将子宫内膜分为A型(三线型，为外层和中部强回声以及内层低回声或暗区，宫腔中线回声明显)、B型(弱三线型，宫腔中线回声不明显)和C型(均质强回声，无宫腔中线回声)。子宫内膜下血流分型标准采用Applebaum分型法，分为Ⅰ型(血管穿过内膜外侧低回声带但未达到内膜高回声外缘)、Ⅱ型(血管穿过高回声外缘但未进入内膜低回声区)和Ⅲ型(血管穿过内膜低回声区)。

1.4 统计学方法

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者年龄、既往移植次数、不孕年限、体重指数、抗米勒管激素(AMH)水平、FSH水平、移植胚囊周期占比及内膜方案比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料比较Tab 1 Comparison of general information between two groups

2.2 两组患者胚胎种植率比较

两组患者平均移植胚胎数、移植优质胚胎率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
PRP+G-CSF组患者的胚胎种植率为46.88%，高于对照组的26.56%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者胚胎种植率比较Tab 2 Comparison of embryo implantation rates between two groups

2.3 两组患者妊娠结局比较

治疗后，PRP+G-CSF组患者的化学妊娠率、临床妊娠率为60.53%、60.53%，高于对照组的31.58%、31.58%，差异均有统计学意义(P<0.05)；
两组患者的早期流产率分别为4.35%、16.67%，差异无统计学意义(P>0.05)；
两组患者均无异位妊娠发生，且PRP+G-CSF组患者无宫腔灌注不良事件发生，见表3。

表3 两组患者妊娠结局比较[例(%)]Tab 3 Comparison of pregnancy outcomes between two groups [cases (%)]

2.4 两组患者子宫内膜情况比较

胚胎移植日，PRP+G-CSF组患者的子宫内膜厚度较对照组厚，子宫内膜血流类型GⅡ型及以上占比、C型内膜占比高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 两组患者子宫内膜情况比较Tab 4 Comparison of endometrium between two groups

2.5 两组患者子宫血流动力学指标水平比较

胚胎移植日，PRP+G-CSF组患者的子宫动脉PI、RI水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 两组患者胚胎移植日PI、RI水平比较Tab 5 Comparison of PI and RI levels between two groups on the day of embryo transfer

伴随胚胎实验室技术的不断提高，IVF在治疗不孕症方面已取得了较好效果，但仍有5%～10%的不孕症患者出现RIF，不能获得临床妊娠[8]。RIF是限制IVF成功率的主要原因之一，其对不孕不育患者的生理及心理都造成了极大影响，更不利于后续治疗[9]。胚胎着床依赖于胚胎质量与ER间的协调，良好的ER是胚胎能顺利植入的前提，因而临床积极治疗改善ER十分重要[10]。PRP来源于自体血液，其血小板浓度为普通血浆的4～5倍，早期用于颌面外科，2015年Chang等[11]首次报告其在治疗子宫内膜≤7 mm的不孕症妇女中具有较好的疗效。Bakhsh等[12]的研究结果表明，采用PRP治疗的RIF女性的妊娠率为20%，高于仅通过宫内导管插入治疗的13.33%，说明PRP能改善妊娠结局。G-CSF是造血系特异性细胞因子，宫腔灌注G-CSF能够通过调节宫腔局部免疫和细胞黏附、影响子宫内膜相关基因的表达，从调节子宫内膜血管重塑等方面改善患者内膜发育状态、促进子宫内膜增厚等，减少妊娠损失[13]。罗燕群等[14]的研究结果表明，RIF患者采用宫腔灌注G-CSF 150 μg治疗2次，其β-hCG阳性率、临床妊娠率分别达到77.5%、68.4%，效果优于灌注1次及0次者。

本研究结果显示，治疗后，PRP+G-CSF组患者的胚胎种植率、化学妊娠率和临床妊娠率分别为46.88%、60.53%和60.53%，高于对照组的26.56%、31.58%及31.58%；
两组患者早期流产率的差异无统计学意义(P>0.05)，两组患者均无异位妊娠发生，且PRP+G-CSF组患者无宫腔灌注不良事件发生，提示PRP联合G-CSF宫腔灌注有助于提高RIF患者的胚胎种植，进而改善其妊娠结局。PRP在改善胚胎植入过程中的分子机制可能为：活化的PRP可直接促进子宫内膜上皮细胞、子宫内膜基质成纤维细胞等增殖、迁移，改善患者宫腔环境；
同时在胚胎植入过程中，PRP中的生长因子可对增殖、免疫和抗炎等起到调节作用，且血小板富集血浆由患者自体提供，不会发生变态反应，具有一定的安全性[15]。宫腔灌注G-CSF能通过血管内皮生长因子(VEGF)促进子宫内膜血管生成，还可通过调节自然杀伤细胞毒性影响局部免疫功能，进而影响妊娠结局。张曦倩等[16]的研究结果表明，宫腔内灌注G-CSF能够通过降低γ干扰素、白细胞介素(IL)17水平以及提高IL-10、转化生长因子β和VEGF水平来调节RIF患者Th1/Th2与Th17/Treg平衡状态，从而提高RIF患者的胚胎种植率、临床妊娠率。因此，PRP+G-CSF联合宫腔灌注可能发挥协同作用，有助于提高RIF患者的胚胎种植率，改善其妊娠结局。

ER与子宫内膜厚度、血流灌注和形态等相关，而内膜下的血流灌注是妊娠成功的重要前提[17]。本研究中，胚胎移植日时，PRP+G-CSF组患者的子宫内膜厚度较对照组厚，子宫内膜血流类型GⅡ型及以上占比、C型内膜占比均高于对照组，PRP+G-CSF组患者的子宫动脉PI、RI水平均低于对照组，提示PRP联合G-CSF宫腔灌注能增加RIF患者子宫内膜厚度，改善其子宫内膜血流、子宫内膜形态，继而改善患者ER。也有研究结果表明，采用宫腔灌注G-CSF治疗能改善RIF患者子宫内膜PI、RI水平，但与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)[18]。该研究结果与本研究结果不同，可能是受到测量手段影响。本研究的创新之处在于，将PRP与G-CSF联合进行宫腔灌注，发挥协同效应，增强治疗效果，还可以减少因其他研究[19]中使用G-CSF反复皮下注射引起的不良反应，操作简单、经济廉价，且具有一定的安全性。本研究也存在一定的不足，本研究为单中心回顾性研究，样本量较小，且PRP用于生殖医学的时间较短，后期将扩大样本量联合多中心进行研究；
同时，PRP联合G-CSF宫腔灌注对于子代的影响也需要进一步研究，而两者联合治疗对于改善胚胎着床的机制也需进行动物实验研究加以验证。

综上所述，PRP联合G-CSF宫腔灌注能改善RIF患者的ER和妊娠结局。