硒酸化乳清分离蛋白抗前列腺癌细胞活性

殷春雁，张 男，林 洁*，李灿鹏,*

（1.云南大学化学科学与工程学院，云南 昆明 650091；
2.西南林业大学材料与化学工程学院，云南 昆明 650224；
3.云南大学生命科学学院，云南 昆明 650091）

逐年上升的癌症发生率和相关的死亡率令全人类担忧[1]。随着肿瘤细胞对标准的化学疗法和放射疗法产生更强的抗性，含硒化合物的抗癌作用逐渐成为研究焦点[2-3]。含硒化合物包括无机硒（亚硒酸盐、硒酸盐）和有机硒化合物，两者均表现出良好的抗癌作用。例如，无机硒中，亚硒酸盐和亚硒酸钠能较好地抵抗前列腺癌[4-5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、肝癌[8]、膀胱癌[9]、恶性胶质瘤[10]、骨肉瘤[11]。有机硒中，硒代蛋氨酸[12]、甲基硒代半胱氨酸[13]、硒代半胱氨酸[14]、硒代胱氨酸[15]对各种癌细胞均具有良好的抑制作用。然而，体内研究表明，无机硒化合物的毒性强于有机硒[10,16]。适中剂量（0.3～0.5 mg Se/kgmb）和饮食剂量（0.01 mg Se/kgmb）的亚硒酸盐在体内代谢为硒化物（Se2-），然后整合到蛋白质中形成硒蛋白[17]。高剂量（＞0.5 mg Se/kgmb）的亚硒酸盐会产生细胞毒性和遗传毒性[2,18-21]，遗传毒性可能导致基因突变，不应长期摄入高剂量的亚硒酸盐[22]。然而，有机硒（如硒代氨基酸）在体内能够非特异地整合到蛋白质中形成硒蛋白（如谷胱甘肽过氧化物酶）或代谢为低分子质量的化合物[23]，更容易随饮食摄入并在组织中保留[22,24-25]，并且表现出低细胞毒性和非遗传毒性[15,22,25]。综上所述，若将无机硒整合到蛋白质中使之转变为有机硒蛋白，则可能兼具抗癌作用、低细胞毒性和非遗传毒性的特点。干燥加热法是一种新型、高效、绿色、环保、安全的食品改性方法[26-30]。基于此，本实验以亚硒酸钠和乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）为研究对象，采用干燥加热法制备硒酸化乳清分离蛋白（selenated whey protein isolate，Se-WPI），并检测Se-WPI对前列腺癌细胞的作用，旨在初步发掘可能会对癌症具有预防、治疗作用的功能食品。

1.1 动物、材料与试剂

雄性昆明小鼠（体质量（20±2）g）由昆明医科大学实验动物学部提供，生产许可证号：SCXK（滇）2015-0004；
使用许可证号：SYXK（滇）K2021-0002。

人前列腺癌细胞株LNCaP（CRL-1740）、DU145（HTB-81）均购自美国ATCC细胞资源中心。

WPI（蛋白质量分数90%） 德国Müller公司；
亚硒酸钠（Na2SeO3）、二甲基硒 上海晶纯试剂有限公司。

碱性蛋白酶（200 U/mg）、胃蛋白酶（USP级，1∶30 000）、胰凝乳蛋白酶（USP级，1 500 U/mg）上海源叶生物科技有限公司；
链霉蛋白酶（7 000 U/g）上海阿达玛斯试剂有限公司；
改良型RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶（USP级，1∶2 500）溶液（1×） 美国HyClone公司；
胎牛血清 美国Gibco公司；
结晶紫、苏木精-伊红染色试剂盒、20 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚赖氨酸、层黏连蛋白、纤连蛋白、基底膜基质 上海碧云天生物科技有限公司；
Cell Counting Kit-8（CCK 8） 日本同仁化学研究所；
BCA蛋白定量试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；
多聚甲醛 无锡耐思生命科技股份有限公司；
细胞DNA含量（细胞周期）即时检测试剂盒江苏凯基生物技术股份有限公司；
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒 美国BD公司；
Caspase 3活力检测试剂盒英国Abcam公司；
Millicell细胞培养小室 北京明阳科华生物科技有限公司；
实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DZF-6050型真空干燥箱 上海博迅实业有限公司；
TG46离心机 长沙英泰仪器有限公司；
DK-98-II型1KW万用电炉 天津泰斯特仪器有限公司；
HH-S数显恒温水浴锅 江苏金坛医疗仪器厂；
T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；
F4500型荧光光度计 日本日立公司；
CK40-F200倒置显微镜 日本Olympus公司；
酶标仪 瑞士Tecan公司；
Astell 040高压灭菌锅 日本Hirayama公司；
血球计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司；
C6流式细胞仪 美国BD公司；
半自动生化分析仪 合肥金浩峰生物科技有限公司；
Avance DRX500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 美国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 干燥加热法制备硒酸化乳清分离蛋白

采用Li Canpeng等[27-28]提出的干燥加热法制备Se-WPI。配制质量分数为2% WPI溶液，加入等质量Na2SeO3，调节pH值为3.0，将上述溶液冷冻干燥72 h获得固体，继续在80 ℃干燥加热24 h后溶解到适量蒸馏水中，置于截留分子质量10 kDa透析袋中，在蒸馏水中透析48 h，以除去粗产品中所含未反应的Na2SeO3，冷冻干燥，得到Se-WPI。以未作任何处理的天然WPI和干燥加热但未经硒酸化的乳清分离蛋白（dry heating whey protein isolate，DH-WPI）作为对照样品。

1.3.2 Se-WPI中有机硒质量分数的测定

Se-WPI中总硒质量分数的测定：采用2,3-二氨基萘荧光法[31]测定，称取20 mg Se-WPI于凯氏分解瓶中，分别加入高氯酸、浓硝酸、体积分数30%过氧化氢溶液各1 mL，电炉上400 ℃加热4 h使其分解完全，至瓶中溶液呈无色透明停止加热，冷却，加入2 mL去离子水，沸水浴煮沸20 min，冷却后定容至10 mL。1 000 μg/mL硒标准溶液经稀释后配制硒质量浓度依次为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 μg/mL的系列标准溶液，以硒质量浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线方程计算Se-WPI中总硒质量分数（Set）。

Se-WPI中无机硒质量分数的测定：4 mL离心管中加入Se-WPI样品5～6 mg，加入2 mL蒸馏水，再加入2 mL质量分数10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，5 000 r/min离心20 min。取3 mL上清液于凯氏分解瓶中，其余步骤与总硒质量分数测定相同，根据标准曲线方程计算Se-WPI中无机硒质量分数（Sei）。

有机硒质量分数（Seo）按式（1）计算。

1.3.377Se-WPI的制备及77Se-NMR分析

参照Duddeck[32]的方法，准确称量20 mg硒粉（77Se），加入3 mL体积分数30%的硝酸溶液，沸水浴中加热30 min后，用酒精灯加热至白色结晶物生成，然后加入2 mL蒸馏水和60 mg WPI，调节pH值至3.0，冷冻干燥，将冷冻干燥后的产物在80 ℃下加热24 h，然后溶解于4 mL蒸馏水中，6 000 r/min离心30 min，重复2～3 次，收集沉淀和上清液。上清液冷冻干燥，回收77Se。

将沉淀溶解在适量蒸馏水中，于0.3 mol/L NaCl溶液中透析24 h，再于蒸馏水中透析48 h，冷冻干燥，得到77Se-WPI。将77Se-WPI样品15 mg溶于1 mL D2O中，然后将溶液装入核磁管中。用融封法将二甲基硒封入毛细管中，再将该毛细管装入核磁管中作为内标。采用NMR仪扫描得到77Se-NMR谱图，扫描参数：温度4 ℃、延迟时间范围0.01～15 s。

1.3.4 Se-WPI中硒酸根稳定性的测定

将一定质量Se-WPI样品溶解于50 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，使其终质量浓度为2 mg/mL。用Britton-Robinson广域缓冲溶液（H3PO4-HAc-H3BO3溶液，各溶质浓度均为0.04 mol/L）和0.2 mol/L NaOH溶液调节样品溶液至不同pH值（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）。将调节pH值后的所有样品溶液于37 ℃水浴24 h。取出蛋白样品溶液，按体积比1∶1加入10% TCA溶液以沉淀蛋白，在3 000 r/min离心30 min，收集上清液。用2,3-二氨基萘荧光法[31]测定Se-WPI样品溶液中上清液所含硒的质量分数。Se-WPI中硒酸根稳定性以脱硒率表示，脱硒率按式（2）计算。

1.3.5 Se-WPI消化率的测定

采用Li Canpeng等[33]的方法进行蛋白质消化实验。称取一定量的WPI、DH-WPI和Se-WPI溶于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）中，使其质量浓度均为2 mg/mL。边搅拌边加入一定体积的10 g/L不同蛋白酶溶液，蛋白质与酶的最佳比例分别为碱性蛋白酶200∶1、胃蛋白酶50∶1、链霉蛋白酶100∶1、胰凝乳蛋白酶200∶1。分别在消化0、2、4、6、8、10、20 min时，各取2 mL溶液，加入2 mL 10% TCA溶液，混匀，3 000 r/min离心20 min，取上清液。采用Lowry法[34]测定上清液蛋白质量浓度并计算氮质量。蛋白消化率按式（3）计算。

1.3.6 Se-WPI抑制前列腺癌细胞增殖实验

1.3.6.1 LNCaP和DU145细胞的培养

LNCaP、DU145细胞均在改良型RPMI-1640完全培养基中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每隔1 d更换一次培养基。当细胞贴壁成致密单层（融合度达85%～95%）时，分瓶扩大培养。

1.3.6.2 WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP细胞增殖最佳作用水平的确定

用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）配制系列不同浓度的Se-WPI、WPI、Na2SeO3溶液，充分溶解后过0.22 µm滤膜以除去杂质。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，采用2,3-二氨基萘荧光法[31]测定硒含量。加入不同终浓度的Se-WPI、WPI、Na2SeO3溶液培养LNCaP细胞24、48、72 h，根据细胞活力确定WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP细胞增殖最佳作用水平。

1.3.6.3 LNCaP和DU145细胞增殖率的测定

采用CCK-8法[35]检测细胞增殖情况。胰蛋白酶消化处理培养至对数生长期的LNCaP、DU145细胞，制备细胞悬液（LNCaP细胞5 000 个/mL、DU145细胞3 000 个/mL），按每孔100 μL接种于96 孔板，培养24 h。然后分别将Se-WPI、WPI、Na2SeO3用RPMI-1640完全培养基配制成一定浓度的溶液，每孔加入100 µL，PBS组为加入100 µL PBS，每组4 个复孔。继续培养24、48 h及72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定450 nm波长处OD值，按式（4）计算细胞活力，并计算Se-WPI、WPI、Na2SeO3对LNCaP细胞半数抑制浓度（50% inhibition concentration，IC50）。

1.3.6.4 结晶紫染色观察LNCaP细胞、DU145细胞克隆形成情况

12 孔板每孔中加入1 mL 5 000 个/mL LNCaP细胞或DU145细胞悬液，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，分别加入1 mL体积分数1% PBS、6 µmol/L Na2SeO3和质量浓度均为22 µg/mL的WPI和Se-WPI溶液（RPMI-1640完全培养基配制），继续培养12 d。吸除旧培养基，用质量分数4%多聚甲醛溶液固定10 min，蒸馏水洗涤2 min，换用新鲜蒸馏水再洗2 min，结晶紫染色10 min，用水充分洗涤，拍照，观察两种细胞形成集落的情况。

1.3.7 Se-WPI对前列腺癌细胞凋亡及黏附影响实验

1.3.7.1 LNCaP细胞周期检测

参照朱孝峰等[36]的方法。6 孔板每孔中加入5×105个/mL LNCaP细胞悬液1 mL，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，分别加入1 mL含体积分数1% PBS和不同终浓度的Na2SeO3、Se-WPI及WPI溶液，Na2SeO3终浓度分别为1.5、3.0 µmol/L，Se-WPI、WPI终质量浓度均分别为6、11 µg/mL（Se-WPI对应硒浓度分别为1.5、3.0 µmol/L），培养48 h。细胞经胰蛋白酶消化，收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，末次洗涤时保留100 µL残留液，将细胞轻轻吹打成单细胞悬液。取50 µL（含1×105个细胞）加入到试管底部，按细胞DNA含量（细胞周期）即时检测试剂盒说明书，加入100 μL A液与细胞悬液轻轻混匀，尽量避免产生气泡，室温孵育10 min；
再加入100 µL B液，操作同上，室温孵育10 min；
加入150 µL C液，操作同上，室温避光孵育15 min。过200 目筛后用流式细胞仪检测。

1.3.7.2 LNCaP细胞率凋亡率检测

参照孔宪涛[37]的方法，6 孔板每孔中加入5×105个/mL LNCaP细胞悬液1 mL，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，分别加入1 mL体积分数1% PBS、3或6 µmol/L Na2SeO3、22 µg/mL WPI、22 µg/mL Se-WPI，（RPMI-1640完全培养基配制），培养48 h。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，预冷的PBS洗涤细胞两次，加入100 µL Binding Buffer重悬细胞（5 000 个/mL），加入5 µL FITC-Annexin V和5 µL碘化丙啶（propidium iodide，PI），室温避光孵育15 min，加入400 µL Binding Buffer，过200 目筛用流式细胞仪检测。

1.3.7.3 Caspase-3活力的检测

参照Philchenkov[38]的方法。当培养瓶中细胞融合度约为70%时，吸除旧培养基，加入6 mL体积分数0.5% PBS、1.5 µmol/L Na2SeO3和质量浓度均为11 µg/mL WPI和Se-WPI溶液（RPMI-1640完全培养基配制），培养48 h。消化收集细胞（包括悬浮细胞），PBS洗涤两次。每1×106～5×106个细胞加入50 µL预冷的细胞裂解缓冲液重悬细胞，冰浴10 min，10 000×g离心1 min，上清液转移至新的离心管中，分装，-80 ℃冻存备用。BCA法测定蛋白质量浓度，将蛋白质量浓度稀释至4 mg/mL。于96 孔板每孔中加入45 µL蛋白样品溶液，空白对照孔内加入等体积双蒸水，然后加入50 µL 2×Reaction Buffer（含10 mmol/L二硫苏糖醇），5 µL 4 mmol/L Caspase 3显色底物，37 ℃孵育2 h。用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度。Caspase-3在1 min内水解产生1 pmol对硝基苯胺为一个酶活力单位（U），Caspase-3活力单位为U/μg。

1.3.7.4 LNCaP细胞对基底膜成分黏附能力的测定

参照Busk等[39]的方法，96 孔板每孔中分别加入30 µL含1% BSA溶液（PBS配制，阴性对照）、3 µmol/L Na2SeO3、22 µg/mL WPI、22 µg/mL Se-WPI和质量浓度均为30 µg/mL的层黏连蛋白、纤连蛋白和基底膜基质溶液，37 ℃孵育1 h。PBS洗一次，加入1% BSA溶液于37 ℃环境中封闭30 min，吸除封闭液，PBS洗一次。每孔加入细胞悬液（LNCaP细胞5 000 个/mL、DU145细胞3 000 个/mL）100 µL，平行3 组，37 ℃孵育2 h。弃除培养基，PBS洗两次，除去未结合的细胞，质量分数4%多聚甲醛溶液固定10 min，蒸馏水洗涤2 min，换用新鲜的蒸馏水再洗2 min，结晶紫染色10 min，用蒸馏水充分洗涤，拍照并计数。按式（5）计算细胞黏附率。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS软件，用方差分析法对实验数据进行统计学处理，采用Origin 9软件作图。

2.1 Se-WPI中的硒质量分数及77Se-NMR分析结果

pH 3.0、80 ℃干燥加热24 h制备的Se-WPI中硒质量分数为2.09%。如图1所示，在77Se-NMR谱中δ1 317处出现硒的吸收峰，与已报道的H2SeO3（δ1 300）[32]、NaHSeO3（δ1 308）[40]非常接近，说明亚硒酸根与WPI发生了如下反应[32]：P-OH+H2SeO3→P-OHSeO2+H2O（P表示蛋白），即H2SeO3与WPI的羟基形成酯，故硒以亚硒酸酯的形式存在于Se-WPI中。

图1 Se-WPI的77Se-NMR谱Fig.1 77Se-NMR spectrum of Se-WPI

2.2 Se-WPI中硒酸根的稳定性

如图2所示，当Se-WPI溶液pH值小于等于10.0，脱硒率较低，均低于3%，说明Se-WPI中硒酸根的稳定性很好；
当Se-WPI溶液pH值增大至11，脱硒率陡增至74.5%，表明强碱环境中Se-WPI上的硒酸根不稳定。该结果进一步验证了O型亚硒酸酯的存在[32,40]。

图2 不同pH值下Se-WPI的脱硒率Fig.2 Rate of selenium removal from Se-WPI under different pH conditions

2.3 Se-WPI的消化性

蛋白被消化后会产生具有生物活性的肽，可以提高蛋白的营养价值、安全性和生理保健功能[41]。一般蛋白质保持原有结构时很难被蛋白酶消化，但当蛋白质经过处理，结构展开，暴露出更多的酶切位点时，其消化性提高[27-28]。本实验采用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对WPI、DH-WPI和Se-WPI进行消化。如表1所示，与WPI和DH-WPI相比，Se-WPI的消化性明显提高。可能是因为在干燥加热条件下，硒酸化过程中WPI暴露出更多的酶切位点，因此Se-WPI的消化性明显优于WPI和DH-WPI。

表1 WPI、DH-WPI和Se-WPI的消化率Table 1 Digestibility of WPI, DH-WPI and Se-WPI%

2.4 Se-WPI对LNCaP、DU145细胞增殖的影响

2.4.1 Se-WPI对LNCaP、DU145细胞生长的抑制作用

选择雄激素依赖型的人前列腺癌细胞（LNCaP细胞）和雄激素非依赖型的人前列腺癌细胞（DU145细胞）两种细胞株，加入不同水平受试药物培养不同时间，评价WPI、Se-WPI和Na2SeO3对前列腺癌细胞生长的影响。

如图3所示，通过实验优化得到WPI、Se-WPI、Na2SeO3抗LNCaP细胞增殖的最佳作用水平分别为WPI质量浓度20 μg/mL，Se-WPI中蛋白质量浓度20 μg/mL、其中硒浓度为5 μmol/L，Na2SeO3浓度5 μmol/L。如图4所示，在最佳作用水平下，相同培养时间，Se-WPI、Na2SeO3对LNCaP细胞生长抑制活性明显强于DU145细胞，且Se-WPI对于两种细胞生长的抑制作用均低于Na2SeO3。WPI对于两种细胞活力均无明显的抑制作用。如表2所示，相同作用时间下，Na2SeO3对LNCaP细胞的IC50均低于Se-WPI，而WPI本身没有明显抑制癌细胞增殖的活性。

表2 Se-WPI、Na2SeO3对LNCaP细胞的IC50Table 2 Fifty percent inhibition concentration (IC50) of Se-WPI and Na2SeO3 against LNCaP cells µmol/L

图3 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞活力的影响Fig.3 Comparison of the effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell viability of LNCaP cells

图4 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP、DU145细胞活力的影响Fig.4 Comparison of the effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell viability of LNCaP and DU145 cells

2.4.2 Se-WPI对LNCaP、DU145细胞克隆形成的影响

在1% PBS、6 µmol/L Na2SeO3、22 µg/mL WPI、22 µg/mL Se-WPI条件下培养12 d后，两种细胞形成集落的情况如图5所示，Se-WPI、Na2SeO3处理组两种细胞集落分散、疏松，进一步证明Se-WPI、Na2SeO3对LNCaP细胞和DU145细胞生长有一定抑制作用，且对LNCaP细胞的抑制作用强于DU145细胞，即LNCaP细胞对于硒化合物的抑制作用更为敏感。因此，在后续实验中主要采用LNCaP细胞作为研究对象。

图5 WPI、Se-WPI、Na2SeO3对LNCaP、DU145细胞克隆形成的影响Fig.5 Effects of WPI, Se-WPI, and Na2SeO3 on clones formation of LNCaP and DU145 cells

以上实验结果均表明，Se-WPI抑制LNCaP细胞增殖的效果明显。虽然Se-WPI对LNCaP细胞增殖的抑制作用略低于Na2SeO3，然而，大量研究表明高剂量（＞0.5 mg Se/kgmb）的Na2SeO3会产生细胞毒性和遗传毒性[2,18-21]，遗传毒性可能导致基因突变，不应长期摄入高剂量的Na2SeO3[22]。而有机硒在体内表现出低细胞毒性和非遗传毒性[15,22,25]，更易随饮食摄入并在组织中保留[22,24-25]。因此，本研究所制备Se-WPI可使硒由于从无机形态转为有机形态，其生物安全性优于Na2SeO3。

2.5 Se-WPI对LNCaP细胞周期及凋亡的影响

细胞周期是指从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累，直到下一次细胞分裂结束为止[39]。凋亡细胞中DNA含量会减少，用PI对其进行染色，PI荧光强度会降低。用流式细胞术进行分析时，在DNA直方图中正常G0/G1细胞群前会出现凋亡细胞峰——亚二倍体峰（sub-G0/G1）。如图6所示，不同水平WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞作用48 h时，体积分数1% PBS处理下细胞生长周期正常，有1.1%的细胞处于凋亡细胞峰。加入6、11 µg/mL的WPI处理相同时间，LNCaP细胞周期未受到影响，处于凋亡的细胞数基本不变。加入Se-WPI或Na2SeO3，细胞周期发生明显变化，处于sub-G0/G1峰的细胞数明显增多，且Na2SeO3处理后处于凋亡状态的细胞分布比例明显高于Se-WPI，Se-WPI或Na2SeO3对细胞周期的诱导呈剂量依赖性。

图6 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞周期的影响Fig.6 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on cell cycle in LNCaP cells

细胞凋亡由遗传机制决定，受到严格的程序调控。正常情况下，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜脂质双分子层内侧，但在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧翻转到外侧，暴露在细胞所处环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合。因此，细胞处于调亡或坏死状态时，FITCAnnexin V染色为阳性。PI是一种不能透过完整细胞膜的核酸染料，但其能够透过处在凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜，使细胞核染红。因此，通过FITC-Annexin V与PI双染可以区分正常、凋亡和坏死细胞[42]。如图7、8所示，Se-WPI或Na2SeO3诱导LNCaP细胞发生凋亡，后者的诱导作用更强。培养48 h时，PBS组的细胞凋亡率为（0.95±0.07）%，而22 µg/mL Se-WPI组凋亡细胞比例达（6.95±0.64）%，是正常状态的7 倍以上，3 µmol/L Na2SeO3组细胞凋亡率为PBS组的20 倍以上，WPI组无明显变化。这说明干燥加热硒酸化修饰赋予WPI诱导细胞凋亡的活性。

图7 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞凋亡的影响Fig.7 Effects of WPI, SE-WPI and Na2SeO3 on apoptosis of LNCaP cells

图8 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞凋亡的影响Fig.8 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on apoptosis of LNCaP cells

Caspase-3可以特异性断裂天冬氨酸残基后的肽键，在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用[43]。Caspase-3常以酶原的形式存在于胞浆中，在细胞凋亡早期被激活，是早期凋亡细胞的标志物。活化的Caspase-3裂解相应的胞浆和胞核底物，进而导致细胞凋亡[38]。如图9所示，相对于PBS组，WPI对Caspase-3活力几乎无影响，Se-WPI和Na2SeO3能够明显提高细胞内Caspase-3活力。表明Se-WPI和Na2SeO3均可以通过活化Caspase-3蛋白，从而诱导LNCaP细胞凋亡。

图9 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞Caspase-3活力的影响Fig.9 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on caspase-3 activity in LNCaP cells

2.6 Se-WPI对LNCaP细胞对基底膜成分黏附能力的影响

转移是恶性肿瘤的基本特征，而细胞黏附是肿瘤转移过程中不可缺少的重要环节[39]。如图10所示，WPI对LNCaP细胞的黏附能力基本没有影响，与PBS组一致，而Se-WPI与Na2SeO3均可明显降低LNCaP细胞对层黏连蛋白、纤连蛋白和基底膜基质的黏附率，表明干燥加热硒酸化改善了WPI的活性，使其具有硒的生物学功能。

图10 WPI、Se-WPI和Na2SeO3对LNCaP细胞黏附能力的影响Fig.10 Effects of WPI, Se-WPI and Na2SeO3 on the adhesion of LNCaP cells to basement membrane components

以上实验从不同方面验证了Se-WPI具有与Na2SeO3相同的抑制LNCaP细胞凋亡的活性。含硒化合物的抗癌机制以诱导细胞凋亡为基础[44]，此外，这些化合物也影响基因表达或各种细胞信号途径，包括DNA修复/损伤、血管再生等[45]。研究表明，由Na2SeO3诱导的细胞凋亡，线粒体是主要的参与者[8,18]。Na2SeO3很容易扩散进入线粒体[20]，与线粒体内还原型谷胱甘肽反应产生过氧化物，进一步引起细胞器表面蛋白质的巯基被氧化。产生的过氧化物和被氧化的巯基打开线粒体膜通透性转运孔[8,46]，线粒体膜电位降低[8,9,20,46]，细胞色素释放到细胞质中[2,46]，激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡[38,43]。本研究中，Se-WPI和Na2SeO3均能显著提高细胞内Caspase-3活力，推测Se-WPI诱导的细胞凋亡途径属于Caspase依赖型[5,20,47]，具体机制还需进一步研究。

本实验采用干燥加热法成功将Na2SeO3整合到WPI中，得到Se-WPI，77Se-NMR和硒酸根稳定性实验结果表明Se-WPI中的硒以亚硒酸酯的形式存在。Se-WPI的消化性得到明显改善；
细胞毒性及集落形成实验结果表明，Se-WPI与Na2SeO3类似，都具有抑制LNCaP细胞、DU145细胞增殖的活性，且呈时间和剂量依赖性，而WPI对两种细胞的增殖没有影响；
LNCaP细胞对硒化合物的抑制作用较敏感；
细胞周期、细胞凋亡和Caspase-3活力检测从不同角度验证Se-WPI具有诱导LNCaP细胞凋亡的作用；
此外，Se-WPI还能够抑制LNCaP细胞与基底膜成分的黏附。本研究结果初步表明，Se-WPI具备作为新型防癌抗癌有机补硒剂的潜力，但其抗癌机制以及细胞毒性和遗传毒性等方面还需进一步研究。