基于转录组序列的芜菁SSR标记开发及应用

李晓娟，赵文菊，赵孟良，邵登魁，马一栋，任延靖，*

(1.青海省农林科学院，青海 西宁 810016；

2.青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，青海 西宁 810016)

芜菁(Brassicarapassp.rapa)，属于十字花科薹属芜菁亚种，是药食兼用的蔬菜作物。芜菁安全无毒，营养丰富，可以长期食用[1]。近代药理研究还发现，芜菁具有抗衰老[2]、抗氧化[3]、降血脂[4]等功效，在食品和药用领域受到广泛关注[5]。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，具有稳定性高、多态性丰富、适用于不同组织及生物发育的不同阶段、不影响目标性状的表达且不受环境影响等优点[6]，目前DNA分子标记技术已有数十种，其中简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)是20世纪80年代发展起来的一种DNA标记技术，具有多态性丰富、共显性遗传、广泛分布于基因组中等特点[7]，近年来被广泛用于种质资源及品种的遗传多样性分析和亲缘分析、质量性状的精细定位及杂交种纯度的鉴定等方面。

在十字花科蔬菜中，SSR标记也被广泛应用于上述几个方面，在白菜中，李桂花等[8]利用SRAP和SSR分子标记对41份小白菜进行了遗传多样性和亲缘关系分析，在遗传相似系数0.58处可将41份小白菜材料分为两大类；
徐营莉等[9]利用72对SSR分子标记检测了5个白菜类优势品种的种子纯度，结果表明，72对SSR引物中筛选出5对具有多态性，能够将父本和杂交种分开；
何晓丽等[10]利用SSR分子标记与农艺性状结合，分析了54份类型差异大、有南方特色的不结球白菜，在遗传距离0.6处将54份不结球白菜分为了3个类型。在芥菜中，李永平等[11]利用芥菜转录组信息挖掘SSR分子标记，并随机选取50对引物扩增44份芥菜种质，结果显示，SSR标记效率高、扩增条带性丰富；
颜新林等[12]构建了基于SSR标记的芥菜品种鉴定技术体系，最终筛选出24对SSR引物作为核心引物用于芥菜品种真实性快速鉴定和遗传多样性分析；
胡齐赞等[13]利用14对SSR分子标记对81份地方芥菜种质资源进行了多样性分析，将这些种质分为了2个类群。

目前关于芜菁在基因组水平上的遗传多样性的研究还未见报道，本研究利用转录组数据开发适合芜菁的SSR分子标记，并对其遗传多样性进行研究，为今后芜菁种质资源的评价和亲缘关系鉴定奠定理论基础。

1.1 试验材料

本研究收集了50份芜菁种质资源，具体信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 转录组测序

采集芜菁种质资源W21和W25的不同发育时期的样品，每个样品3个重复，每个重复包含6个单株，委托武汉迈特维尔生物科技有限公司进行转录组测序分析。建库的方法参考公司已有的流程，首先获取芜菁的mRNA，随后加入片段化缓冲液将RNA打断成短片段，以短片段RNA为模板，用六碱基随机引物合成第一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA 聚合酶I合成二链cDNA，随后进行双链cDNA的纯化，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库，获得的cDNA文库首先进行检测，检测方法包括使用Qubit2.0进行初步定量，使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段符合预期后采用q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，库检合格后，用Illumina HiSeq平台进行测序[14]。

1.2.2 基因组DNA的提取

试验材料种植于青海大学农林科学院园艺所1号试验基地内，待芜菁成熟时选取芜菁新鲜的幼嫩叶片，液氮冷冻研磨，采用改良的CTAB法[15]提取基因组DNA。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-20 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计与合成

采用MISA软件对芜菁转录组的Unigene基因进行SSR检测，搜索条件为单碱基(mono-nucleotide)重复SSR、双碱基(di-nucleotide)重复SSR、三碱基(tri-nucleotide)重复SSR、四碱基(tetra-nucleotide)重复SSR、五碱基(penta-nucleotide)重复SSR和六碱基(hexa-nucleotide)重复SSR，最低重复次数分别为10、6、5、5、5、5次。从芜菁10条染色体上各随机选择3条unigenes序列，利用Primer3软件设计引物，随机挑选的30对引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

表1 供试材料信息

1.2.4 PCR扩增及结果检测

20 μL PCR反应体系包括：DNA模板1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 5 μL，上下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用8%非变性聚丙烯酰胺进行电泳检测。

1.2.5 数据统计

采用人工读带的方法，将聚丙烯酰胺电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，同一位置条带较弱或者无条带的记为“0”，以此建立原始数据的0-1矩阵。通过Popgene1.31和PIC-CALC软件进行SSR位点的遗传多样性分析，利用NTSYS-pc1.0软件进行聚类分析。

2.1 芜菁转录组中SSR位点的分布及特点

通过对芜菁的253 720条unigene序列(序列总长为250 929.08 kb)进行分析发现，在63 553条unigene序列中含有79 716个SSR位点，其中13 247条unigene中含有2个或2个以上SSR位点。SSR的发生频率(含SSR的unigene基因数/总unigene条数)为25.05%，平均每3.15 kb出现1个SSR，分布频率(SSR个数与总unigene条数之比)31.42%。SSR位点搜索结果显示，有单一SSR位点(每个位点仅包含一种类型的SSR)和复杂SSR位点(每个位点包含至少两种类型的SSR)两种类型，以单一SSR位点为主，有54 482个，占比68.35%，其中单核苷酸重复是主要类型，占总SSR位点的31.1%；
其次是三核苷酸和二核苷酸重复，分别占19.46%和16.88%；
四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重复类型数量最少，分别为0.58%、0.16%和0.17%。所有单一SSR位点中，10次重复的SSR位点最多，共16 979个，占总单一SSR位点数的31.16%；
9次重复的SSR位点最少，只有1 650个，仅占总数的3.03%(表2)。芜菁SSR位点长度从10～308 bp不等，总长1 508 444 bp，平均长度18.92 bp；
其中长度在10～24 bp的SSR位点数量最多，有71 348个，占总数的89.50%，长度>25 bp的有8 368个，占总数的10.50%。

表2 芜菁单一SSR的类型、数量及分布特征

2.2 芜菁转录组SSR基序重复类型和频率特征

从芜菁转录组SSR核苷酸基序类型(表3)看，54 482个SSR位点包括266个重复基元，单核苷酸至六核苷酸重复类型分别有4、12、60、81、54和55种。根据碱基互补配对原则和阅读起始碱基顺序的差异[16]，对每种长度类型的重复基元进行同类兼并后，单、二、三、四、五、六核苷酸重复基元类型分别为2、4、10、26、26和44个，单核苷酸重复基序最多，包括A/T和C/G，其中A/T数量最多，占总SSR位点的45.24%；
二核苷酸重复中，AG/GT数量最多，有9 288个，占总SSR位点的17.05%；
三核苷酸重复中，AAG/CTT和AGG/CCT数量最多，分别有5 054和2 656个，占总SSR位点的9.28%和4.88%；
四、五、六核苷酸重复中，基序数量较多，没有发现数量上有较为显著的基序类型(表3)。

表3 芜菁SSR基序类型分布

2.3 引物筛选及应用

从分布在芜菁10条染色体上SSR引物中随机选30对(表4)，以50份芜菁叶片DNA为模板，进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺电泳检测扩增结果(图1)。30对引物最终均获得了多态性高、条带清晰的结果，共扩增出多态性条带126条，平均每对引物扩增出4.2条，平均多态率100%。

表4 芜菁SSR引物序列及扩增结果

序号同表1。The numbers of 1-50 were the same as in Table 1.图1 部分引物在50份供试材料的电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of 50 tested materials with partial primers

扩增条带最多的引物是Cluster-30924.76636，为13条，最少的是Cluster-30924.104122、Cluster-30924.109584、Cluster-30924.120390、Cluster-30924.22191、Cluster-30924.48364和Cluster-30924.93982，只有1条。根据电泳检测扩增结果，最终得到24对多态性高、条带清晰的芜菁SSR引物，占总引物的80%。

2.4 遗传多样性分析

遗传多样性分析结果见表5，24对SSR引物在50份芜菁材料中共扩增获得了101个等位基因，每个位点等位基因数(Na)为2～7个，平均每个位点等位基因数4.21个，平均有效等位基因数(Ne)为1.4817个，有效等位变异率(有效等位基因数占观测等位基因数的比例)为35.19%。其中引物Cluster-30924.164312的有效等位基因数最多为1.856 3个，引物Cluster-30924.87846的有效等位基因数最少为1.020 3个。期望杂合度(h)的平均值是0.287 0，最大位点是Cluster-30924.164312，最小位点是Cluster-30924.87846，变化范围是0.019 9～0.455 1；
多样性指数(I)分布在0.056 2～0.646 0，平均值为0.438 5；
多态性信息含量(PIC)变化范围为0.038 4～0.914 7，平均为0.569 1，其中有14对引物的多态性信息含量大于0.5，属于高多态性引物，占总引物数的46.67%。结果表明，通过24对引物能够揭示50份芜菁资源的遗传多样性。

2.5 聚类分析

根据30对引物的扩增结果，采用最大似然法对50个芜菁材料进行聚类分析。结果可知(图2)，50个供试芜菁材料的遗传背景较为复杂。在遗传距离大于20的地方，将50份芜菁材料分为四大类，第一类包含7份材料，分别是W22、IC22、T17、1402、W25、IC23和IC28，这7份材料在形态学上差异极大；
第二类包括40份材料，占总供试材料的80%，第二类又可以分为两小类，分别包含28份和12份材料；
第三类包括了2份材料，分别为T4和NS1；
第四类仅包括1份材料，IC9。

表5 二十四对SSR引物的遗传参数

图2 五十份芜菁材料SSR标记的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 50 varieties of the turnip based on SSR markers

芜菁为十字花科芸薹属芸薹种芜菁亚种能形成肉质根的2 a生草本植物，具有很多重要的遗传特性[17]，它是具有较长历史的药食同源类植物，不仅可提供人体必需的各种氨基酸，还可降低各种疾病的发病率，提高免疫力。因此对芜菁进行遗传多样性分析，是很有必要的。

转录组测序能够快速、准确地获得物种全转录本序列信息，不依赖于物种的全基因组信息，且价格低廉，在不同物种的分子标记开发中已被广泛应用[18-19]，而SSR标记是很好的共显性标记，多态性丰富且位点单一稳定，标记带型简单，是很好的锚定标记，有助于染色体的归并和不同连锁群的整合[20]，转录组序列多集中在功能基因上，因此基于转录组数据开发的SSR标记有利于后期与重要性状进行关联分析，这也为分子标记辅助育种工作中亲本选育过程节约了时间和成本[21]。因此SSR标记被广泛应用于各类蔬菜和水果中，张春红等[22]利用SSR标记分析蓝莓(Vacciniumcorymbosum)现有品种种质的遗传多样性，发现品种间遗传差异较丰富，利用UPGMA聚类以及结合不同类型种质的系谱分析，发现分类与品种种质的遗传成分相似有一定的相关；
刘新雨等[23]利用大蒜(Alliumsativum)转录组数据进行SSR分子标记分析，在遗传相似系数0.756 9处，35份大蒜资源可被分成5大类群；
杨亮等[24]为探究收集于国内外不同番茄(Solanumlycopersicum)种质资源的亲缘关系，选用48对SSR引物对856份番茄材料进行遗传多样性及群体结构分析，根据番茄果实大小将其分为野生番茄(7份)、樱桃番茄(207份)及栽培型番茄(642份)3大类群，通过群体结构分析将856份材料划分为4个类群，两种类群划分有相似的结果。李延龙等[25]利用MISA软件筛选韭菜(Alliumtuberosum)全长转录组测序检测出的SSR位点，设计了3 311对SSR引物，随机选取164对引物(78.85%)进行扩增试验，39对引物在24株韭菜中表现出多态性种质资源。

本研究对芜菁转录组序列进行了SSR位点检测与信息分析，并通过PCR扩增检测引物有效性和多态性。研究结果表明，在63 553条unigene序列中含有79 716个SSR位点，其中13 247条unigene中含有2个或2个以上SSR位点。SSR的发生频率为25.05%，平均每3.15 kb出现1个SSR，分布频率为31.42%。通过聚丙烯酰胺电泳检测扩增结果显示，30对引物最终均获得了多态性高、条带清晰的结果，共扩增出多态性条带126条，平均每对引物扩增出4.2条，平均多态率100%。根据电泳检测扩增结果，最终得到24对多态性高、条带清晰的芜菁SSR引物，占总引物的80%，24对SSR引物在50份芜菁材料中共扩增获得了101个等位基因，每个位点等位基因数(Na)为2～7个，平均每个位点等位基因数4.21个，平均有效等位基因数(Ne)为1.481 7个，有效等位变异率为35.19%，表明筛选出的引物能较好地表现50份芜菁的遗传多样性。

综上所述，本研究采用SSR分子标记方法，揭示了芜菁的遗传多样性，并筛选出了适合芜菁种质资源评价鉴定的EST-SSR引物，在芜菁的资源多样性分析、杂交种鉴定及遗传图谱的构建应用中具有重要意义。