miR-129-5p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭的影响及其作用机制研究

孙永梅 焦 鹏

肺癌是常见恶性肿瘤之一，在所有肿瘤中致死率位居第一。非小细胞癌细胞与小细胞癌相比生长分裂慢，扩散相对较晚[1]。虽然临床已采用手术、放化疗等综合治疗手段，但治疗效果并不理想。靶向治疗近来在肿瘤治疗中发挥重要作用[2]。有研究表明miR-129-5p异常表达与多种肿瘤细胞增殖密切相关[3-4]。但miR-129-5p在非小细胞肺癌中的生物学功能研究较少。本研究通过探讨miR-129-5p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭的影响及其可能的作用机制，分析其在非小细胞肺癌疾病进展中作用，为临床靶向治疗非小细胞癌提供新的理论依据。

1.1 材料

非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H157、GLC-82(中国医学科学院细胞库)；
Trizol提取试剂盒(赛默飞世尔科技中国有限公司)；
BCA蛋白试剂盒、Lipofectamin 2000试剂盒(瑞士Roche公司)；
RPMI 146、DMEM培养基(南通市百奥迈科生物公司)；
MTT实验相关试剂(美国Promega公司)；
Transwell实验相关试剂购(美国BioLEgend公司)；
兔源一抗(β-catemin、Cy-clin D1，MMP-2、MMP-9、JAK、p-STAT3、STAT3、c-myc、GAPDH)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(美国Cell Signal Technology公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及瞬时转染 肺癌细胞株A549、NCI-H157、GLC-82均培养于含10%胎牛血清的RPMI 146培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO2浓度。将第3代A549细胞以4×105/孔接种到12孔细胞培养板上培养，实验当天取细胞培养箱于显微镜下观察细胞密度，细胞80%融合更换不含胎牛血清的新鲜RPMI 146培养基即可进行转染。将Lipofectamin 2000转染试剂稀释轻轻混匀，室温孵育5 min记为混合物1。另将miR-129-5p mimics、miR-129-5p NC分别稀释于500 μL无血清培养基中调整终浓度为20 μmol/l，室温孵育5 min，记为混合物B。将A和B轻轻混匀，室温孵育20 min，分别加入相应培养孔，另设不添加转染试剂作为对照组。6 h后弃去培养基，更换含10%胎牛血清的RPMI 146培养基。48h后收集细胞供后续试验。

1.2.2 荧光实时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法检测 收集各组已处理细胞，参照Trizol说明书提取总RNA，进行qRT-PCR操作。miR-129-5p和内参U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列详见表1。2-ΔΔCt算法计算miR-129-5p相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 蛋白质印记(Westernblot)法检测 将蛋白裂解buffer(含protease inhibitor Cocktail)加入1.2.1中各组细胞提取总蛋白。BCA蛋白试剂盒测定细胞中总蛋白含量，以GAPDH为内参，采用Western blot检测各组细胞中增殖相关蛋白β-catemin、Cyclin D1，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9及STAT3通路相关蛋白JAK、p-STAT3、STAT3、c-myc、GAPDH蛋白水平进行检测，Tanon 600图像分析系统拍照并进行定量分析。做3次重复，取平均值。

1.2.4 MTT试验 将1.2.1中各组细胞接种96孔板，在0、24、48、72、96 h时间点每孔加入10 μl浓度为1.5 mg/ml的MTT，培养 4 h后各孔内加入150 μl DMSO，读取各孔吸光度值(A)，绘制细胞生长曲线，以未接种细胞只加培养基孔的A值为空白对照调零。

1.2.5 平板克隆试验 收集对数期细胞接种在12孔板中，细胞密度调整为1×104个/ml，37 ℃、5%CO2培养10 d，PBS溶液清洗后采用4%甲醛固定菌落30 min，1%结晶紫溶液染色20 min，水洗干燥后拍照统计算细胞克隆数量。

1.2.6 细胞侵袭试验 收集各组细胞，取100 μl的Matrigel胶平铺于上层小室。上室每孔加入细胞悬液100 μl(细胞数约为1×105，无血清培养基稀释)，下室加入500 μl含10% FBS的完全培养基。37 ℃孵育24 h。取出小室，用PBS冲洗两遍，用棉签除去滤膜上室面的细胞和Matrigel胶，1% 多聚甲醛固定下室面细胞后加入Giemsa染色30min。用倒置显微镜随机选取5个视野计算穿膜细胞数，并拍照。实验重复3次，取平均值表示细胞的侵袭能力。

1.3 统计学方法

2.1 非小细胞癌细胞系中miR-129-5p相对表达量

BEAS-2B、A549、NCI-H157、GLC-82细胞株中，miR-129-5p相对表达量分别为(1.01±0.21)(0.17±0.04)、(0.72±0.18)、(0.68±0.16)，后三者均显著低于正常细胞株BEAS-2B中miR-129-5p相对表达量(P<0.05)，其中A549细胞株中miR-129-5p表达量下降最显著。后续试验选取A549细胞株。见图1。

图1 非小细胞肺癌细胞株miR-129-5p相对表达量

2.2 转染效率检测

倒置荧光显微镜下观察miR-429 NC组、miR-429 mimics组细胞转染效率均达90%以上，与空白组相比，miR-129-5p NC组miR-129-5p相对表达量差异不显著(P>0.05)，miR-129-5p mimics组miR-129-5p相对表达量升高(P<0.05)；
与miR-129-5p NC组相比，miR-129-5p mimics组miR-129-5p相对表达量升高(P<0.05)，见表2。

表2 三组miR-129-5p相对表达量

2.3 miR-129-5p过表达对非小细胞肺癌细胞增殖的影响

MTT试验显示，miR-129-5p NC组各时间点细胞OD值与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)，miR-129-5p mimics组48 h 开始细胞OD值显著低于空白组(P<0.05)及miR-129-5p NC组(P<0.05)，见图2。

注：a为与空白组相比，P<0.05；
b为miR-129-5p NC组比较，P<0.05。

2.4 平板克隆法检测miR-129-5p过表达对增殖能力的影响

与空白组相比，miR-129-5p NC组细胞形成数差异无统计学意义(P>0.05)，miR-129-5p mimics组细胞形成数显著降低(P<0.05)；
与miR-129-5p NC组相比，miR-129-5p mimics组细胞形成数显著降低(P<0.05)。

2.5 miR-129-5p过表达对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响

Transwell试验显示，miR-129-5p NC组侵袭细胞数与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)，miR-129-5p mimics组侵袭细胞数与空白组相比显著降低(P<0.05)；
与miR-129-5p NC组相比，miR-129-5p mimics组侵袭细胞数显著降低(P<0.05)，见图3、表3。

表3 Transwell实验检测miR-129-5p过表达对A549细胞侵袭能力的影响

2.6 miR-129-5p过表达对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭相关蛋白表达的影响

Western blot检测显示，与空白组相比，miR-129-5p NC组增殖相关蛋白β-catemin、Cyclin D1、侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，miR-129-5p mimics组β-catemin、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)；
与miR-129-5p NC组相比，miR-129-5p mimics组β-catemin、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05),见图4、表4。

表4 miR-129-5p过表达对非小细胞肺癌细胞侵袭相关蛋白表达的影响

2.7 miR-129-5p过表达对STAT3通路相关蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与空白组相比，miR-129-5p NC组JAK激酶、p-STAT3、STAT3、c-myc蛋白表达差异不显著(P>0.05)，miR-129-5p mimics组JAK激酶表达水平、STAT3磷酸化水平、c-myc表达水平降低(P<0.05)；
与miR-129-5p NC组相比，miR-129-5p mimics组JAK激酶表达水平、STAT3磷酸化水平、c-myc表达水平降低(P<0.05)，见表5、图5。

注：a为空白组,b为miR-129-5p NC组,c为miR-129-5p mimics组。

注：a为空白组,b为miR-129-5p NC组,c为miR-129-5p mimics组。

表5 Western blot检测STAT3通路蛋白表达情况

注：a为空白组；
b为miR-129-5p NC组；
c为miR-129-5p mimics组。

非小细胞癌是肺癌的一种，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，约占所有肺癌的80%，因为缺乏对非小细胞肺癌早期有效诊断指标，约75%患者发现时已处于中晚期，5年内生存率很低[5-7]。因此寻求非小细胞癌的靶点具有重大意义。近年来，miRNA在恶性肿瘤发生发展中的重要作用受到广泛关注[8]。有临床研究表明，miR-129-5p在非小细胞癌中过表达，其表达水平与肺癌分期、淋巴结转移情况和预后有关[9-10]。因此本研究通过转染过表达miR-129-5p，研究miR-129-5p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其可能的作用机制。

Zhang等[11]研究发现miRNA-129-5p在非小细胞肺癌组织中表达水平显著低于其对应正常黏膜组织，上调miR-129-5p表达后，癌细胞增殖速率降低，且c-myc及clyclinD1蛋白的表达明显下降，猜测miR-129-5p上调可以有效地抑制非小细胞肺癌细胞的生长，并诱导其凋亡。You等[12]研究表明，亚油酸苯胺羟肟酸可通过上调miR-129-5p诱导硫氧还蛋白1介导肺癌细胞凋亡。Shen等[13]也表明，miRNA-129-5p在喉癌组织中低表达。Xu等[14]经研究显示miRNA-129-5p在胶质母细胞瘤的组织和细胞系中呈下调状态。本研究中选取正常细胞株BEAS-2B和三株非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H157、GLC-82作为研究对象，经qRT-PCR法检测，A549、NCI-H157、GLC-82细胞株miRNA-129-5p表达均低于BEAS-2B，推测miRNA-129-5p可能参与非小细胞肺癌的发生发展进程，其中A549细胞株miRNA-129-5p相对表达量最低，因此后续试验均选用A549细胞株。A549细胞株转染miR-129-5p mimics使之过表达后，miR-129-5p表达水平显著高于空白组与miR-129-5p NC组，表明转染效率较高。MTT和平板克隆试验显示，转染后miR-129-5p mimics组48 h后OD值、克隆形成数显著低于空白组，提示miR-129-5p过表达参与非小细胞肺癌增殖过程，增殖相关蛋白β-catemin、Cyclin D1表达也显著降低，提示miR-129-5p过表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。肿瘤细胞具有高度的侵袭能力，可侵入邻近区域，并通过降解细胞外基质成分转移至远处器官，MMP-2和MMP-9在肿瘤细胞的局部侵袭转移中起重要作用。本研究显示，miR-129-5p过表达显著降低细胞侵袭能力，进一步研究显示，miR-129-5p过表达后侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低，推测miR-129-5p可能参与非小细胞肺癌癌细胞侵袭过程。

STAT3通路是近年来发现的一条参与细胞增殖、分化、凋亡等过程的信号通路[15]。STAT3是STAT家族的一员，大量研究表明STAT3在多种癌症中被持续激活，其除受细胞因子、G蛋白偶联受体、钙黏着蛋白结合、Toll样受体调节外，还受到miRNA的调节，在癌症发生发展中具有至关重要的地位[16-18]。有学者[19]研究发现，miR-1181可能通过靶向STAT3参与胰腺癌细胞的侵袭和增殖。Shen等[13]研究表明，miR-129-5p对喉癌细胞具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡作用，且miR-129-5p的抗肿瘤作用是通过调控STAT3信号通路下游靶基因c-myc实现，据此猜测，miR-129-5p对STAT3信号通路可能通过类似调控发挥作用。本研究显示，miR-129-5p过表达使STAT3信号通路JAK激酶水平、STAT3磷酸化程度降低，致使c-myc表达水平下降。可能由于miR-129-5p过表达抑制JAK激酶表达，进而抑制STAT3蛋白转录，最终下调靶基因c-myc的表达水平，进而抑制肿瘤的增殖、侵袭过程。

综上所述，本研究上调miR-129-5p可抑制非小细胞肺癌增殖、侵袭过程，可能通过抑制STAT3信号通路激活实现，有望成为非小细胞肺癌治疗的靶点。